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Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina, Universidad de Chile
TECNOLOGA DE MICROARRAYS Y ANALISIS DE DATOS
Programa de Biologa Celular y Molecular 6 Septiembre 2010
Dra. Nevenka Jureti D.
BIOINFORMTICA
Biologa Computacin Tecnologa de la informacin
Microarrays
Arreglo ordenado de secuencias de DNA conocidas sobre un sustrato slido (soporte).
Soportes1.- Filtros o membranas de nitrocelulosa o nylon 2.- Silicio 3.- Portaobjetos de vidrios cubiertos con: aminosilanos aldehdos epoxi polilisinaUrza 2006
Superficies qumicas
Fabricacin1.- Sntesis in situ sobre un soporte slido (vidrio) a) Fotolitografa (Affymetrix) Sondas cortas Muy caro b) Tecnologa a chorro de tinta (ink-jet) Sondas ms largas Ms barato, se basa en qumica convencional
Fabricacin
2.- Deposicin mecnica de sondas presintetizadas: a) Oligonucletidos b) Productos de PCR c) EST (Expressed Sequence Tagged)
Urza 2006
Tipos de microarrays1.- Microarrays de DNA: DNA o cDNA depositado sobre soporte slido 2.- Microarrays de oligonucletidos: Oligonucletidos directamente sintetizados in situ sobre el soporte slido Generalmente se sintetizan en el mismo punto hasta 20 oligos perteneciente al mismo cDNA.
Tipos de microarrays de DNA1.- Microarrays en portaobjetos Fabricacin mediante spotting o microinyeccin
2.- Microarrays de alta densidad o DNA chips
Sntesis de sondas in situ (Affymetrix) Fotolitografa
3.- Chips microelectrnicos o Nano Chips
Tecnologas de Microarrays Affymetrix Spotting
Que nos permite un array?
Identificacin de una secuencia de DNA (gen/mutacin de un gen) Determinacin del nivel de expresin (abundancia) de genes
Se utilizan para estudiar el perfil de expresin de miles de transcritos a la vez.
Tcnica de MicroarraysRNA de muestras control RNA de muestras estimuladas
Marcacin con Alexa 555-dUTP Alexa 647-dUTP
Hibridacin a 58C toda la noche Escaner laser dual Microarray
Anlisis computacionalSoftware GenePix Pro 3.0
Marcacin fluorescente
(Herrera 2007)
- Cyanine 3-dUTP
532 nm 635 nm 555 nm 647 nm
Fluorforos ms utilizados
- Cyanine 5-dUTP - Alexa 555-dUTP - Alexa 647-dUTP
Principio bsico: hibridacin
Hibridacin
Urza 2006
Cmara de hibridacin
TE
Array Cubreobjeto PortaobjetoLABEL
Nmero (marca)
Lavados
Urza 2006
Escaner
Urza 2006
Variables que pueden afectar los resultados
Calidad del RNA
Pureza Integridad
Cantidad de RNA disponible
Amplificacin del RNA1) Sntesis de la primera hebra de cDNA
2) Tallo de la primera hebra de cDNA
3) Sntesis del promotor T7
4) Transcripcin in vitro
Pregunta biolgicaDiseo experimental Experimento de microarrays
Anlisis de imagen Preprocesamiento y Normalizacin Anlisis estadstico Anlisis fxProc. biolgicos / vas / cluster / etc
Verificacin biolgica e interpretacin
Anlisis de imgenesSoftware GenePix Pro 3.0 (imgenes en tiff a gpr y jpg)
Image
Analyze Image
Scan Wash Hybridize probe to Array
Gal file(Gene array list file)
Control
Experiment
DNA Samples
Bloque con grilla superpuesta
Bloque alineado
Resumen de las etapas del anlisis de imagen Programa Gene Pix Pro- Se abren las imgenes escaneadas (.tif) - Se descarga el archivo GAL apropiado (.gal) - Se alinea la grilla con los bloques impresos del array - El programa realiza las mediciones - Los resultados se obtienen como archivos .gpr
Obtencin de datos crudos
Normalizacin
Correccin tcnica (experimental) Ajuste de los resultados a un estndar comn que permite corregir la diferencias de las intensidades de hibridaciones entre experimentos (genes housekeeping)
Preprocesamiento
1.- Remover los replicados inconsistentes 2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays 3.- Inputacin (KNN-Inpute)
1.- Remover los replicados inconsistentes
X
2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays
X
3.- Inputacin (KNN-Inpute)
Valor asignado mediante algoritmo
Preprocesamiento
1.- Remover los replicados inconsistentes 2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays 3.- Inputacin KNN-Inpute
Matriz de datos completos y normalizados
Preprocesamiento Normalizacin
Anlisis estadstico
Datos crudos
Datos completos y normalizados
Set de genes
Anlisis funcional
Bases de datos
TIPOS DE BASES DE DATOS
Base de datos privadas Base de datos pblicas
Base de datos privadaBase de datos para Microarrays del National Cancer Institute of Frederick, EEUU
mAdb(microarray database)
http://nciarray.nic.nih.gov
Image
Software GenePix Pro 3.0 (imgenes en tiff a gpr y jpg)
MicroArray database (mAdb)
Analyze Image
Format and Upload Image and Data
Scan Wash Hybridize probe to Array
Web/ Application Server
Central Expression Database
Control
Experiment
MGD
KEGG
TIGR
DNA Samples
GenBank (via Entrez)
UniGene
dbEST*
GeneCards
External Databases
Internal Databases
mAdb Home Page (http://nciarray.nci.nih.gov)
Creacin de un proyecto
MicroArray database (mAdb)
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)
Filtros adicionales % de arrays
Razn mayor o igual a 2 (simtrico)
Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)
Resultados expresados como Promedio ER (Log2)
MicroArray database (mAdb)
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)
Filtros adicionales % de arrays
Razn mayor o igual a 2 (simtrico)
Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)
Resultados expresados como Promedio ER (Log2)
Subir los archivos a la base de datos
Arrays Ingresados a la base de datos
MicroArray database (mAdb)
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array (dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background) Filtros adicionales % de arrays, Razn mayor o igual a 2 (simtrico) Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)
Resultados expresados como Promedio ER (Log2)
Selecting Filtering Options Signal Calculation: Median Int Median Bkg Normalization Method: 50th Percentile (Median) Default Ratio: ChanB/ChanA
Exclude any Spots indicated as Bad or Not Found Signal >= 200 and 200 Override if Chan B Signal >= 5000 Override if Chan A Signal >= 5000
Filtros segn la calidad del spot Go to next page to choose arrays
Resultado
Spot que cumplen con las caractersticas asignadas
MicroArray database (mAdb)
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)
Filtros adicionales
% de arrays, Razn mayor o igual a 2 (simtrico)
Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)
Resultados expresados como Promedio ER (Log2)
Selecting spots based on value characteristics
Anlisis estadstico
Anlisis funcional
Clustering
Base de datos pblica GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es)
GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es)
Anlisis funcional de genes: 1) FatiGO de GEPAS
2) FatiGO Plus de GEPAS
Otros links de inters
1) Venn Diagram Generator(http://pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi)
Diagrama de Venn
131 131
19 19
Grupo 1
113 113
Genes comunes Grupo 2
Figura 1: Se ingresaron 2 listas de genes, una con 150 y la otra con 132 genes. En el diagrama se observa el nmero de genes que se expresan diferencialmente en cada grupo de estudio.
2) SOURCE Search(http://smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch)
Figura 2: Bsqueda de informacin sobre el gen de Interleuquina-6Datos ingresados: Organism: Mus musculus Option: Gene name/Symbol Term: IL-6
3) Chilibot (http://www.chilibot.net)
Figura 3: Se ingres una lista con 44 genes y se realiz la bsqueda utilizando la palabra clave calcio. En el esquema se observan todos los genes que de alguna manera estn relacionado con calcio, segn la base de datos del pubmed.
Pregunta biolgicaDiseo experimental Experimento de microarrays
Anlisis de imagen Preprocesamiento y Normalizacin Anlisis estadstico Anlisis fxProc. biolgicos / vas / cluster / etc
Verificacin biolgica e interpretacin
Gracias! Contacto: njuretic@med.uchile.cl