Post on 06-Apr-2016
Chromatographie
Physikalisch-chemische Trennmethoden, bei denen die Stofftrennung auf einer unterschied-lichen Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase beruhen.
Was ist Chromatographie?
Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen
• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert.
• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen.
• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.
Mechanismen der Trennung
1. Adsorptionsgleichgewicht (feste stationäre Phase, flüßige mobile Phase): z.B. HIC, Adsorptionschromatographie.
2. Verteilungsgleichgewicht (flüßige stationäre Phase, flüßigeoder gasförmige mobile Phase): z.B. Verteilungschrom., RP, GLC
3. Ionenaustauschgleichgewicht (Ionentauscher als stationäre Phase, Elektrolyt als mobile Phase): z.B. Ionentauschchrom.
4. Gleichgewicht zwischen einer mobilen und einer stag-nierenden flüßigen Phase : z.B. Gelpermeation, SEC
5. Gleichgewicht zwischen einem immobilisierten Liganden und einer flüßigen mobilen Phase: z.B. Affinitätschromatog.
Verteilungskoeffizient
Der Verteilungskoeffizient Kd beschreibt wie sich eine Substanz zwischen zwei (nicht mischbaren) Phasen verteilt.
Kd = Konzentration in Phase AKonzentration in Phase B
Kapazitätsfaktor
Der Kapazitätsfaktor beschreibt die effektive Verteilung.Er besagt welche Menge an Substanz sich in einer Phase befindet.
Kx =
Damit ist der Kapazitätsfaktor von der Menge der Phasen abhängig.z.B.: Kd=1 und stat. Phase : mob. Phase = 10 : 1
10 x mehr in A als in B
Anzahl Mol in stationärer Phase Anzahl Mol in mobiler Phase
Die Trennung
I
S
D
C
Das Chromatogramm
Programmstart
Basislinie
Detektor-Signal
Lösungsmittel-Peak
Zeit
Der Peak
tR ... Retentionszeit t‘R ... Netto-Retentionszeit tM ... Totzeit w ... Basisbreite
Kapazitätsfaktor
k‘ = =tR - tM
tM
t‘RtM
Det
ekto
rsig
nal
tM tR1 tR2 Zeit
tM
tR1
tR2
h
w
wh
Relative Retention (Trennfaktor)
k‘ ist von der Säulenlänge und von der Geschwindig-keit der mobilen Phase unabhängig!
Peaks werden nur getrennt wenn k1‘ und k2‘ unterschiedlich sind.
Trennfaktor ist ein Maß für die Selektivität des Systems
wird durch die Eigenschaften der mobilen und stationären Phase bestimmt.
k2‘
k1‘
Die Auflösung
Die Auflösung R zweier benachbarter Peaks A + B ist definiert als:
2 (tRB - tRA)
wA + wB
R =
R = 1.5
R = 0.5
R = 0.8
Trennstufenmodell
N = 16 . ( )2 Trennstufen (theoretische Böden)
H = Höhenequivalent eines theor. Bodens (HETP)
Zahl der theoretischen Trennstufen N gibt an, wie oft eine Gleichgewichtsein-stellung entlang der Säule erfolgen kann. Das Höhenequivalent gibt an, auf welcher Strecke (Länge) sich das Gleichgewicht einmal einstellen kann.
tR
wLN
Beinflussung der Auflösung
R = 0.25 . ( - 1) . N . ( ) 1 + k‘k‘
Selektivität des Systems„Wechselwirkungen“
Leistungsfähigkeitder Trennsäule
Stärke desElutionsmittel
Verbesserung der Auflösung
1. Relative Retention ()Änderung der station. PhaseWechselwirkungen der mob.
2. Trennstufenzahl (N)bessere oder längere Säule (2L1.4R); v von mobil. Phase
3. Kapazitätsfaktor (k‘)Stärke der mobilen Phaseändern
N
k'
N und k' bleiben gleich
und k' bleiben gleich
N und bleiben gleich
Quantifizierung
Etablierung der Basislinie
Messung der Peak-Flächen oder -Höhen
Einfache Kalibration
Gebrauch von Internen Standards
Die Basislinie
Die Basislinie ist nicht (immer) eben!
„Drift“ der Basislinie
„Tailing“ oder „Fronting“
spät eluierende Peaks
schlecht getrennte Peaks
Säulenbluten
Peak-Fläche und Peak-Höhe
Abschätzung der Peak-Fläche A über die Breite auf halber Höhe (wh = b0.5)
A = wh . h
Mit Integratoren oder Computerprogrammen errechenbar. Erkennung des Peak-Anfangs und -Endes wichtig.
Einfache Kalibration
Für jede Substanz wird eine Kalibrationskurve erstellt. Kalibration sollte mindestens 4 Konzentrationen beinhalten und mit jeder neuen Charge an Proben neu erstellt werden!
Kalibration mit internem Standard
Flächen-Quotient
FQ1 = = = 1.05
FQ2 = = = 1.91
FQ3 = = = 2.81
PQ1 = = = 1,61
entspricht 1.64 Konz
Fläche Std 1 1,05Fläche IStd1 1,00
Fläche Std 1 1,62Fläche IStd2 0,85
Fläche Std 1 2,98Fläche IStd3 1,03
Fläche Probe 1,35Fläche Istd P 0,84
Konzentration
0 1 2 3 4
Fläc
henq
uotie
nt
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
x = 1.136 y - 0.18
Fläc
he
Klassifikation der Chromatographie
Planare Chromatographie:DünnschichtchromatographiePapierchromatographie
Säulenchromatogrphie:Flüssigchromatographie (LC, HPLC, IEC, GPC)Gaschromatographie (GLC, GSC)
HPLC & GCMethode Stationäre Phase Prinzip
(A) HPLCLLC flüssig, adsorb. Feststoff VerteilungLSC Feststoff (z.B. Silikagel) AdsorptionIEC Ionentauscher IonenaustauschSEC Polymer mit Poren Molekülgröße
(B) GCGLC flüssig, adsorb. Feststoff VerteilungGSC (a) Feststoff Adsorption
(b) Molekularsieb Molekülgröße