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Para conta r con c arac terstic asfenotp ic as y geno tp icasnicas de la espec ie.
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Es un ma terial biolgic o d e referenc iacertificado.La c olecc in d e d onde se ob tienen (p e j.ATCC) c ertific a q ue ha suministrad o unadete rminad a ce pa , que e s un cultivo puro,y que se ha c arac terizad o po r prueba smorfolgicas, bioqumicas y molecularesadecuadas.
Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
Investiga cin c ientfic a y tec nolgica Estudios epid emiolg icos Estudios de diversidad microb iana Estudios de evoluc in Desarrollo tecnolgico
Obtenc in y co ntrol de p rod uctosfarmacuticos, incluyendo los biolgicos.
Control de c alidad en o tros tipo s deindustria (p ej. la industria a lime nta ria )
Control de c alidad en la clnica
entre o trasDra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
Para demostrar trazabilidad.
El nmero y la elec c in del gne ro yespe c ie de los mismos de pe nde r delos ensayos que se e fec ta n y lasnec esida des particula res de stos.
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Evaluac in de la c alidad de los med ios decultivo.
Rea lizac in de c ontrol de ca lida d internodurante la ejec ucin d e los ensayos.
Rea lizac in de c ontroles de c alidad d ereactivos.
Realizacin de pruebas confirmatorias.
Valida cin de mtod os.Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
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Viabilidad
Pureza (lib re d e c ontam inante s).
Que no presente c am bios fenotpic os nigenotpicos
Recuperar:
En la misma c ond icin a la q uetena ante s de ser c onservado .Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
Es e l p roceso de verif icac in dela identidad d e una c epatipo, a l c omparar lasc a ra c t erst ic a s d e la c e p a t ip oc o n a q ue lla s e sta ble cid as a lnivel d e esp ec ie y d e c ep a.
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Es el someter una cepa auna serie de pruebas:
morfolgicas, fisiolgicas, moleculares, inmunolgicas, etc.
y que son caractersticaspara cada cepa en loparticular.
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Plazo corto: Cultivo en me dio inclinado
Plazo med iano:
Cultivo en me dio inclinad o e inmerso en a ce itemineral
Cultivo en me dio lquido y ma ntenido a -20oC
Cultivo deseca do en un sopo rte de p ap el filtroPlazo largo :
Cultivo en me dio lquido y ma ntenido a -70oC a-196oC Cultivo liofilizad o
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Consideraciones:
Mtod o simple Cada pase aumenta la probabil idad de
mutacin.
Requiere espa cio de laboratorio
El tiempo de c onservacin vara dep endiendo
de la espec ie bac teriana
El tiempo d e estabilida d g entica vara
dependiendo d e la espec ie bacterianaDra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
El med io:
Debe c onte ner nutrientes que pe rmitan el desarrollobac teriano a una velocidad ba ja
No de be ser restrict ivo en nutrientes, ya q ue p ued e
favorecer mutaciones adaptativas
Rico favorece el crecimiento y debe realizarse pases
ms frecuentem ente
Caldo soya tripticasena con c rioprotec tor es un buen
ejemplo.
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El med io con el cultivo co nservado:
En una c aja d e Petri a tem peratura am biente sufre
desecacin.
En un tubo de rosca co n sello d e p arafilm, a
temp eratura am biente y lejos de la luz pued e
c onservarse po r me ses.
En un tubo de rosca co n sello d e p arafilm, a 4oC y
lejos de la luz pue de co nservarse po r ms meses
(excepto especies con enzimas autolticas)Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
En un tub o d e rosc a c on sello d e
para film, a 4oC, lejos d e la luz einmerso en ac eite mineral p ued e
c onserva rse p or 2 o tres aos
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En un c riotub o de rosc a, a -20oC
pued e c onserva rse p or 6 me ses a
2 aos
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En una bo lsa c on c ierre he rm tico ylas tiras de p ap el filtro imp reg nad as
c on la b ac teria y d esec ad as al vac o
pue de n c onservarse ha sta 4 aos
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Ultracongelador, -
70oC
Nitrg eno lquido , -
196oC
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Viales. Plstico o
vidrio
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GLICEROL AL 25% +SUERO DE CABALLOCALDO SOYA TRIPTICASEINACALDO TOOD HEWITT YEMA DE HUEVO
DIMETIL SULFXIDO
ETILEN Y DIETILEN-GLICOL
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Entra a la c lula, glice rol 10%> d imetil
sulfxido (DMSO) 5%
Alred ed or de la c lula, lec he
descremada 20%> manitol> dextran>
po livinil pirrolido na> po liglic ol
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Conge lac in del c ultivo:
Congelac in controlad a 1oC/min
Nitrgeno lquido primero en
ultracongelador
Ultrac ongelador direc tamente
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Desc ong elac in de l c ultivo:
Punto c rtico -35oC a -5oC
Rp ida a 37oC
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SUBLIMACIN DEL AGUA A
PRESIONES REDUCIDAS
EL AGUA ES SEPARADA DE
LA MUESTRA A PARTIRDE
CRISTALES DE HIELO PURO Y
ELIMIN NDO SE LENTAMENTE EN
FORMA DE VAPOR
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En la ma yora d e los casos es el mejor m tod o
de c onservac in (no ag ua, no c ristales).
Hasta 30 aos para b ac terias
Daino para hongos, protozoarios y virus
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Viales. vidrio
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Soportes
Lec he d escrem ad a a l 20% pa ra liofilizac in
en cma ra
Sac arosa a l 12% para liofilizac in d e
entradas mltiples
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PENETRAN A LA CLULA
Son cap ace sd e difundirse en ella y diluirlos
electrolito internos.
NO PENETRAN A LA CLULA
La fun ci n e s p ro vo c a r la sa lid a d e l a g ua ,
aumentando la concentrac in in terna de los
solutos
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Leche descremad a
Aminocidos
Azcares
Protenas
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LAS CEPAS LIOFILIZADAS SE MANTIENEN VIABLES, PURASY CON SUS CARACTERSTICAS ESTABLES POR VARIOSAOS SIN REQUERIR ALMACENAJE EN CONDICIONESESPECIALES.
LOS CAMBIOS QUMICOS SON MNIMOS YA QUE SEPREVIENEN MEDIANTELA ADECUADA CONC ENTRACINDESOLUTOS Y EL USO DE BAJAS TEMPERATURAS, LO QUEDISMINUYELA VELOCIDAD DELAS REACCIN QUMICA
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ALTO COSTO DEL EQUIPO
REQUIERE DE MAYOR ESPACIO
PERSONAL CAPACITADO
SE HA COMPROBADO QUE PUEDE INDUCIR
MUTACIONES
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Mtodo deconservacin
Crioprotector Temperatura deconservacin (oC)
Tiempo deconservacin
(aos)
Subcultivo Ninguno Ambiente 0.3
Aceite mineral Ninguno 4 0.6-2
Co ng el ac i n Sac ar os a
Glicerol
-20 1-3
Ultracongelacin Leche descremada
Sacarosa
Glicerol
-70 -196 1-30
L iof i lizacin Leche descremada
Sacarosa
4 30
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Mtodo deconservacin
Crioprotector Temperatura deconservacin (oC)
Tiempo deconservacin
(aos)Subcultivo Ninguno Ambiente 0.1-0.3
Aceite mineral Ninguno 4 1-2
Co ng el ac i n Sac ar os a
lactosa
-20 1-2
Ult racongelacin Sacarosa,
Lactosa
Glicerol
-70 -196 2-30
Liofilizacin Leche descremada +
Sacarosa+ Lactosa
4 30
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1 era op cin: Obtenc in direc ta a p artir de unacolecc in nacional o internacional reco nocida.
2 da opc in: Provee do res come rciales ce rtificad os.Come rcializan resiembras de ce pa s de referenciaad quiridas en una c oleccin reconocida.Gene ralmente e l 3o o 4o pa se. Debe n ma ntener susrecipientes originales. Requerimiento en la recepcin(com pra de insumo) : ce rtificad o de origen dond eco nste el nmero de p ase y el origen d e la ce pa , entreotros.
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AOAC FDA
NCCLS
USP
FARMACOPEAS: CEU,JAPN, UK, MXICO
Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN America n Type Culture Collection
Dra.RosaMaraRibas,ENCB-IPN
ATCC- Ame rican Type
Culture Colle ctio n, EE.UU.
NCTC- National Collection
of Typ e Cultu res-Reino
Unido ENCB- Mxico
CECT- ColeccinEspaola de Cultivos Tipo
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http:// www.atcc .org/CulturesandProducts/Mic robiology/ BacteriaandPhages/FeaturedCultures/tab id/1788/Default.aspx#co li
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NCB-I
PN
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NCB
-IPN
EL ABASTO O CULTIVO PARA DISTRIBUCI NSE DERIVA DE UN ABA STO SEMILLA Y ES ELQUE SE OFRECE A LOS LABORATORIOS
SOLICITANTES A MA NERA DE C ULTIVOMAESTRO.
SE DEBE DETERMINAR:
PUREZA, VIABILIDAD IDENTIDAD ESTABILIDAD DEL FENOTIPO
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Esquemade cultivosdereferencia:
*Controlesde pureza ypruebasbioqumicas
de la cepa.
Sesubcultivauna solavez
Solo se acepta un pase
Sistema lote-semilla
Modificado de la FAODra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN
Adq uisicin de c epa de referenc ia (Cepade referencia):
- Req uisitos de co mp ra y registro de lacep a adq uirida.
Subcultivo de Cepa de referencia:- Control de p ureza y viabilida d (REGISTRO). Preparacin de la cep a d e reserva.- Control de p ureza y viabilida d peridicos
(REGISTRO) .- Registro de c ada frasco de la nueva c epa
de reserva incorporada al ce pario.
PROVEEDOR DE CEPA
LABORATORIO
LABORATORIO
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Las c ep as de referencia ingresan a llaboratorio de microbiologa se registransegn procedimiento.
Se a lmac ena n entre 0-5 C hasta su uso. Se reconstituyen y se siembran utilizandoel med io de c ultivo, las c ond iciones deincub ac in y el proc edimiento indica doen las instrucc iones pa ra c ad a t ipo d emicroorganismo.
En paralelo, se les realiza un control deca lidad de p ureza y viab ilida d y seregistra.
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Definicin: Cepas idnticas obtenidas mediante unnico subcultivo de una cepa d e referencia.[ISO 11133-1:2000].Las cep as de reserva son una serie de alcuota s decultivos idnticos obtenidas en el laboratorio porsubcultivo de la c epa de referencia.
Las obtenemos siguiendo el sistema lote semilla.CREF
Cres
Cres
Cres
Cres
Cres
Cres
PASE
UNICO
Las cep as de reserva las prep ara y c onserva el lab orato rio.
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Dentro d el lab oratorio de be ha ber un lugardestinado p ara
almac enar las cepas de reserva.
Debe e star clarame nte sealad oque se trata de ce pa s potenc ialmente peligrosas
y su m anipula cin restringida
a persona l autorizado.
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Identificac in del tipode cepa .
Gnero y espec ie delmicroorganismoTipo y N decoleccin.N de lote.Fecha de recep cin.Control de ca lidad dela cepa de referenciaConfo rme (SI/NO).Fecha de c aduc idadde la cepa.Personal responsable.
REGISTRO DECEPAS DE RESERVA:
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En el ca so d e d esco ngelamiento d e las ce pa s dereserva, stas no de be n volverse a co nge lar.
El criovial co n cultivo vencido se elimina d elcep ario y se registra.
Cuand o se fracc ionan alcuota s en leche u o trosag ente s crioprote ctores, se usan, se d esco nge lany no se pueden volver a congelar ni a usar.
Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no sepued en vo lver a usar.
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Subc ultivos de m icroorganismos obtenidos apa rtir de la s c epas de reserva para serutilizad os en los ensay os que lo prec isen.
Obtencin de ce pas de trabajo:Los c ultivos de traba jo se ob tienen a pa rtir de laCep as de reserva sob re un med io slido o lquido noselectivo adecuado utilizando un asa estril eincuba ndo en c ondiciones adec uadas.
Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN