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fpen AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO
CARACTERIZAO DOS EFEITOS DA RADIAO
IONIZANTE EM PELE HUMANA PARA ALOENXERTO
SELMA CECLIA BOURROUL
Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear-Aplicaes.
Orientadora: Dra. Monica Beatriz Mathor
So Paulo 2004
48
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES Autarquia associada Universidade de So Paulo
CARACTERIZAO DOS EFEITOS DA RADIAO
IONIZANTE EM PELE HUMANA PARA ALOENXERTO
SELMA CECLIA BOURROUL / /
Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de iviestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear -Aplicaes
Orientadora:
Dra. Monica Beatriz Mathor
SO PAULO 2004
minha me, por ter me mostrado os primeiros caminhos.
Ao Armando, por ter tornado minha escolha possvel.
Ao Giuliano, por sua alegria.
Agradecimentos
A Dra. Mnica Beatriz Mathor, pela orientao sempre presente, por sua amizade e
principalmente compreenso.
Ao CNPq, pela bolsa de Mestrado.
Ao IPEN, pela oportunidade do desenvolvimento deste trabalho.
Ao Dr. Jos Roberto Rogero, Presidente da Comisso de Ps Graduao, pelo apoio
nossa participao em Congressos, que se traduziu na divulgao e enriquecimento deste
trabalho.
Diviso de Ensino, em especial ao Fernando Moreira, Ilze Puglia, Vera Lucia
Garcia e Ana Maria Benassi, pelo apoio e ateno.
Ao CTR, pelo acolhimento e por propiciar condies para o desenvolvimento do
nosso trabalho.
Dra. Marisa Roma Herson, por seu interesse, sugestes e inestimvel colaborao
pessoal que possibilitaram a realizao deste trabalho.
Ao Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clnicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de So Paulo, pelo fornecimento dos tecidos necessrios
pesquisa.
Ao Dr. Eddy Segura Pino, por ter tomado possvel a caracterizao biomecnica da
pele, mas principalmente, por suas importantes sugestes neste estudo.
Ao Dr. Sergio Ferreira de Oliveira, por seu interesse neste trabalho, por ter
realizado o estudo e anlise ultra-estrutural dos tecidos iiTadiados.
Ao amigo Msc. Alex Kors Vidsiunas, pela preparao e incluso das amostras para
observao no microscpio eletrnico de transmisso.
Ao Gaspar Ferreira de Lima, por seu profissionahsmo nos cortes e contrastao do
material para microscopia eletrnica.
Dra. Kayo Okasaki, Msc. Mriam Suzuki e Dra. Mrcia Silva, pelas
instrues nas observaes e registros fotogrficos da microscopia ptica.
Ao Dr. Jarbas Arruda Bauer, excelente professor, por apresentar a histologia como
um estudo dinmico e integrado.
Ao Dr. Wilson Aparecido Parejo Calvo, pela colaborao e informaes sobre
irradiao no acelerador de eltrons.
Aos Eng. Eifsabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira, pela irradiao das
amostras, sugestes e explicaes. Ao Hlio Antonio Paes, pela fabricao do dispositivo
de proteo do termopar para as medidas de temperatura no acelerador de eltrons.
Msc. Clia Marina Napolitano e ao Ethel Martins Pedroso pela dosimetria.
Ao Manuel Nunes Mori, pela padronizao do corte das amostras e pela realizao
dos primeiros ensaios biomecnicos.
Ao Djalma Batista Dias, pela realizao dos ensaios biomecnicos e por suas
explicaes sobre a tcnica de funcionamento da mquina Instron, que possibilitaram
minha independncia na realizao dos ensaios de trao .
Ao Daniel Cavalh, pela ajuda na padronizao das amostras para o estudo
biomecnico.
amiga Elisa Santos, pela colaborao nas primeiras lminas histolgicas.
Wilma Conceio Montilha pela reahzao da anlise estatstica.
Ao Laboratrio de Histologa do Departamento de Patologia da Faculdade de
Medicina da Universidade de So Paulo, pela preparao das lminas histolgicas. A
Silvana Altran do Laboratrio de Cirurgia Plstica e Microcirurgia da FM-USP, por sua
colaborao na entrega das amostras para histologa.
amiga Dra. Suzi Frey Sabato, companheira de congi-esso, por sua amizade e
incentivo.
amiga Dra. Sueli Borrely, pelo incentivo e conselhos.
Aos amigos de equipe Maria Ftima Klingbell, Andrea Cecilia Dorion Rodas,
CjTiara Viterbo, Karina Lima e Lus Otvio Carvalho Kosmiskas, pelo apoio.
Aos amigos de CTR, Msc. Icimone Oliveira, Maria Fernanda Romanelh, Maria
Cristina Moraes, Daniela Nardi e David Tsai, por sua amizade e ajuda.
Aos amigos do ICB Ana Luca Mota, Augusto Montezano e Angela Bruni, por suas
sugestes e amizade.
s amigas Mrcia Celina Valdez dos Santos e Nancy Umisedo , que mesmo
distncia sempre deram seu apoio e carinho.
Agradeo especialmente ao Prof Flavio Delmanto, Diretor do Ncleo de Sade do
Centro Universitrio UnFMU, pois foram sua compreenso e generosidade que
possibHtaram a minha dedicao integral a este trabalho.
cmssho NKomi D Emm\ HCLEAR/SP-PEM
CAKACTERIZA.O DOS EFEITOS DA RADIAO IONIZANTE EM PELE
HUMANA PARA ALOENXERTO
Selma Ceclia Bourroul
RESUMO
A pele desempenha papel fundamental na viabihdade do organismo. Nos casos de leses extensas, os aloenxertos apresentam-se como uma alternativa para cobrir temporariamente essas reas. Aps triagem do doador, a pele processada em ghcerol concentrado (acima de 85%), pode ser armazenada nos Bancos de Tecidos. O glicerol nessa concentrao possui efeito bacteriosttico porm h necessidade de quarentena. A esterilizao da pele por radiao ionizante o mtodo mais indicado pois reduz o prazo para transplante do enxerto em pacientes e sua confiabilidade considerada excelente. Os objetivos deste trabalho foram estabelecer procedimentos de utilizao de duas fontes distintas de radiao ionizante para esterihzao de pele humana destinada ao aloenxerto, e avaliar a pele aps exposio irradiao gama e feixe de eltrons. Foi realizada a caracterizao do tecido quanto a resposta aos ensaios de trao por meio da comparao dos valores do mdulo de elasticidade entre amostras-controle e irradiadas. Amostras de pele foram submetidas a doses de 25 kGy e 50 kGy no in-adiador de ^Co e no acelerador de eltrons. Foram reahzados tambm estudos de morfologa e ultra-estmtura. As amostras irradiadas com gama a 25kGy, no apresentaram diferena sigTiicava quanto aos valores do mdulo de elasticidade em relao ao controle. As amostras submetidas irradiao gama a 50 kGy e ao feixe de eltrons a 25 kGy e 50 kGy apresentaram diferena significativa quanto aos valores do mdulo de elasticidade em relao ao controle. A anlise das ultramicrografas revelaram modificaes na estrutura e modificao no padro de estriao das fibrilas de colgeno da derme das amostras irradiadas.
COESO mioim. DE Em\^ HuaiAwsp-PEM
CHARACTERIZATION OF IONIZING RADIATION EFFECTS ON HUMAN
SKIN ALLOGRAFTS
Selma Ceclia Bourroul
ABSTRACT
The skin has a fundamental role in the viabihty of the human body, hi the cases of extensive wounds, allograft skin provides an alternative to cover temporarily the damaged areas. After donor screening and preservation in gtycerol (above 85%), the skin can be stored in the Skin Banks. The glycerol at this concentration has a bacteriostatic effect after certain time of presei-vation. On the other hand, skin sterilization by ionizing radiation may reduces the quarantine period for transplantation in patients and its safety is considered excellent. The objectives of this work were to establish procedures using tvvo sources of ionizing radiation for sterilization of human skin allograft, and to evali.iate the skin after gamma and electron beam irradiation. The analysis of stress-strain intended to verify possible effects of the radiation on the structure of preserved grafts. Skin samples were submitted to doses of 25 kGy and 50 kGy in an irradiator of ^Co and in an electron beam accelerator. Morphology and ultra-structure studies were also accomplished. The samples irradiated with a dose of 25kGy seemed to maintain the biomechanic characteristics. The gamma irradiated samples with a dose of 50 kGy and submitted to an electron beam at doses of 25 kGy and 50 kGy presented significant differences in the values of the elasticity modulus, in relation to the control. The analysis of the ultramicrographies revealed modifications in the structure and alterations in the pattern of collagen fibrils periodicity of the irradiated samples.
CCMSSO W\Qr^L C i ENER&iA KuCLEAR/SP-IPEh!
SUMARIO
Pgina
1 INTRODUO 17
2 OBJETIVOS 20
3 CONSIDERAES GERAIS 21
3.1 A PELE HUMANA 21 3.1.1 Funes 21 3.1.2 Morfologa 22 3.1.2.1 Epiderme 22 3.1.2.2 Membrana Basal 23 3.1.2.3 Derme 23 3.1.2.3.1 Fibras Colgenas 24 3.1.2.3.1 Fibras Elsticas 28 3.1.3 Caracterizao Biomecnica da Pele Humana 29 3.2 ALOENXERTO 30 3.3 ESTERILIZAO 32 3.3.1 Esterilizao por Radiao Ionizante 32 3.4 RADIAO IONIZANTE 33 3.4.1 Radiao Gama 33 3.4.2 Feixe de Eltrons 34 3.4.3 Efeito Direto e Efeito Indireto da Radiao Ionizante 35 3.5 FONTES DE RADIAO IONIZANTE 35 3.5.1 Irradiador de Cobalto 60 (''"Co) 35 3.5.2 Acelerador de Eltrons 36
4 MATERIAIS E MTODOS 39
4.1 MATERIAIS 39
4.1.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS 39 4.1.2 IRRADIADORES 40 4.1.2.1 Irradiador de CobaIto-60 40 4.1.2.2 Acelerador de Eltrons 40 4.1.3 ENSAIOS BIOMECNICOS DE TRAO 40 4.1.3.1 Corte do corpo de prova 40 4.1.3.2 Ensaios de resistencia trao 41 4.1.4 ESTUDOS MORFOLGICOS 41 4.1.4.1 Microscopio ptico 41 4.1.4.2 Microscopio eletrnico de transmisso 41
4.2 MTODOS 42
4.2.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS 42 4.2.1.1 Manipulao do material biolgico e instrumentos 43 4.2.1.2 Descarte do material biolgico 43
4.2.2 ENSAIOS BIOMECNICOS DE RESISTENCIA TRAO 43 4.3 HISTOLOGIA 45 4.4 ULTRA-ESTRUTURA 46 4.5 ANALISE ESTATSTICA 47 4.5.1 Anlise estatstica descritiva 47 4.5.2 Teste de significncia 47
5 RESULTADOS 50
5.1 CARACTERIZAO DAS AMOSTRAS 50 5.2 TESTES BIOMECNICOS DE RESISTNCIA TRAO 51 5.2.1. Amostras submetidas irradiao gama e ao feixe de eltrons com dose de
25 kGy 52 5.2.1.1 Anlise estatstica 55 5.2.1.1.1 Anlise estatstica descritiva 55 5.2.1.1.2 Teste de significncia 56 5.2.2 Amostras submetidas ao feixe de eltrons com modificao do sistema de
transporte e da temperatura com dose de 25 kGy 58 5.2.2.1 Registro de temperaturas no acelerador de eltrons 60 5.2.2.1.1 Sistema de transporte de esteira 60 5.2.2.1.2 Sistema de transporte de bandeja 61 5.2.2.2 Anlise estatstica 64 5.2.2.2.1 Anlise estatstica descritiva 64 5.2.3 Amostras submetidas irrradao gama e feixe de eltrons com dose de
SOkGy 65 5.2.3.1 Anlise estatstica 67 5.2.3.1.1 Anlise estatstica descritiva 67 5.2.3.1.2 Teste de significncia 68 5.2.4 Amostras submetidas a irradiao gama e feixe de eltrons irradiadas com
doses crescentes de 10 kGy a 50 kGy 70 5.3 ESTUDO HISTOLGICO 72 5.3.1 Hematoxilina-eosina 72 5.3.2 Mallory 72 5.3.3 Picro-sirius 72 5.3.4 Resorcina 72 5.4 ESTUDO ULTRA-ESTRUTURAL 73
6 DISCUSSO 84
7 CONCLUSES 92
APNDICE A - Valores do mdulo de elasticidade (MPa) das amostras do grupo controle e dos grupos irradiados a 25 kCy !00
APNDICE B - Valores do mdulo de elasticidade (em MPa) das amostras do grupo controle e dos grupos irradiados a 50 kGy 101
APNDICE C - Teste de Mann-Whitney para pequenas amostras (n
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 3.1 - Representao da molcula de colgeno formada por 3 cadeias alfa. O aminocido glicina est indicado em cor mais forte na regio interna da molcula (modificado de Alberts, 1997). 2S
FIGURA 3.2 - Estrutura da fibra de colgeno: as fibras de colgeno so formadas por unidades menores, as fibrilas, constitudas por macromolculas denominadas tropocolgeno que esto paralelamente organizadas. O tropocolgeno formado por trs cadeias peptdicas de estrutura alfa- ligadas por pontes de hidrognio (modificado de Gartner & Hyatt, 2001). 26
FIGURA 3.3 - Pontes de hidrognio na molcula de colgeno: (A) entre tomos que formam a alfa-hhce (intra-molecular); (B) entre as trs molculas alfa que fonnam o tropocolgeno (intermolecular), (modificadas de Lehninger, 1976). 27
FIGURA 3.4 -Mquina Universal de Ensaios Instron.(A) Aspecto geral , controles e sistema computacional. (B) Garras segurando corpo de prova.. 30
FIGLIRA 3.5 - Irradiador de cobalto-60 Gammacell-220. (1) cmara secundria com recipiente para amostras; (2) cmara primria (3) Painel de controle. 36
FIGURA 3.6 - Acelerador de eltrons Dynamitron JOB-188. (1) sistema de varredura; (2) bomba de vcuo; (3) bandeja com suporte para simostras; (4) esteira transportadora. 38
FIGURA 4.1 - Exemplo de amostras de tiras de pele de espessura parcial acondicionadas em embalagem selada trmicamente, com identificao de que o material foi irradiado (seta). 39
FIGURA 4.2 - (A) Faca de ao, em foniiato de halteres, para corte de corpo de prova, montada em suporte de madeira; (B) dimenses do corpo de prova; (G) extensmetro; (C) corpo de prova de pele. 41
FIGUHA 4.3 - Grfico obtido com o software Merlin 2.21, mostrando o prolongamento da poro linear ( / ) e a indicao dos valores de tenso (aj e (J2) e de alongamento ( 8 1 6 8 2 ) para clculo do mdulo de elasticidade de acordo com a equao E = Aa/Ae (3). 45
FIGLTIA 5.1 - Grfico obtido com o software Merlin 2.21 para a amostra n 3 do gi-upo controle do doador VlIIb. (/) A reta em azul foi construda manualmente para evidenciar a parte linear da curva. 51
FIGURA 5.2 - Relao entre "stress" x "strain" em 5% das amostras testadas. A seta indica a resistncia trao da camada comeificada da epiderme aps a niptiira da demie. 52
FIGURA 5.3- Valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) para amostras irradiadas com gama e submetidas ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy. 53
FIGURA 5.4 - Grfico comparativo dos valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) das amostras dos grupos controle dos seis doadores. 54
FIGURA 5.5- Grfico de porcentagem dos grupos experimentais submetidos irradiao gama e ao feixe de eltrons, com dose de 25kGy, em relao ao controle. 55
CCMSSO !#tC10mL D B^mik m(iEmsp-?m
FIGURA 5.6 - Mdulo de Elasticidade dos grupos irradiados com gama e com eltrons, em porcentagem em relao ao grupo controle de cada doador. (-) A reta em vermelho representa o valor limite entre os dois efeitos. 56
FIGURA 5.7 - Grfico comparativo dos valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) para amostras ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy transportadas por esteira e bandeja temperatura ambiente (ta) e sob resfriamento (resf). 59
FIGURA 5.8 - Grfico de porcentagem dos grupos experimentais submetidos ao feixe de eltrons, com dose de 25kGy, transportados em esteira e bandeja temperatura ambiente (ta) e sob resfiiamento (fesf), em relao ao controle. 60
FIGURA 5.9 - Variao da temperatura durante a irradiao a 10 kGy pelo sistema de esteira e de bandeja no acelerador de eltrons, com e sem resfiiamento (em porcentagem). A reta () indica a temperatura ambiente utilizada como referncia. 63
FIGURA 5.10 - Variao das temperaturas durante a irradiao a 25 kGy pelo sistema de bandeja no acelerador de eltrons, com e sem resfriamento (porcentagem). A reta () indica a temperatura ambiente utilizada como referncia. 64
FIGURA 5.11 - Mdulo de Elasticidade dos grupos submetidos ao feixe de eltrons, em porcentagem em relao ao grupo controle de cada doador. () A reta representa o valor limite mximo para as amostras transportadas por esteira temperatura ambiente. 64
FIGURA 5.12 - Valores de Mdulo de Elasticidade (em MPa) pai'a amostras controle e irradiadas com gama e submetidas ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. 66
FIGURA 5.13 - Valores do mdulo de elasticidade (em MPa) das amostras dos grupos controle para amostras irradiadas com dose de SOkGy. 66
FIGURA 5.14 - Grfico de porcentagem dos grupos experimentais submetidos irradiao gama e ao feixe de eltrons, com dose de SOkGy, em relao ao controle. 67
FIGURA S.15 - Mdulo de Elasticidade dos grupos irradiados a SOkGy com gama e com eltrons, em porcentagem em relao ao grupo controle de cada doador. () A reta em vermelho representa o valor limite entre os dois efeitos. 68
FIGURA 5.16 - Efeito da irradiao crescente sobre os valores das mdias do mdulo de elasticidade das amostras submetidas radiao gama e ao feixe de eltrons. 71
FIGURA 5.17 - Efeito da irradiao crescente sobre os valores das mdias do mdulo de elasticidade das amostras submetidas radiao gama e ao feixe de eltrons, em porcentagem. 71
FIGURA 5.18 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com hematoxilina-eosina, observadas ao microscpio de luz. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de elfi-ons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. Aumento: 400x. 74
FIGURA 5.19 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com Mallory, observadas ao microscpio de luz. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao
feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. Aumento: 400x. 75
FIGURA 5.20 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com picro-sirius, observadas ao microscpio de luz polarizada. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. As setas (->) indicam feixes de fibras de colgeno I. Aumento: 400x. 76
FIGURA 5.21 - Fotomicrografas de pele para aloenxerto coradas com resorcina, observadas ao microscpio de luz. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. As setas ( ^ ) indicam fibras de elastina. Aumento: 400x. 77
FIGURA 5.22 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso. (A) Amostra controle; (B) Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy; (C) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy; (D) Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy; (E) Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. As setas ( ^ ) indicam fibrilas de colgeno I em corte longitudinal. Aumento: lOOOOx. 78
FIGURA 5.23 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso. Amostra controle (ampliada). Aumento: lOOOOx. 79
FIGURA 5. 24 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida radiao gama com dose de 25 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx. 80
FIGURA 5.25 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx.. 81
FIGURA 5.26 - Ultramicrografas de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida radiao gama com dose de 50 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx. 82
FIGURA 5. 27 - Ultramicrografias de pele para aloenxerto observadas ao microscpio eletrnico de transmisso: Amostra submetida ao feixe de eltrons com dose de >0 kGy (ampliada). Aumento: lOOOOx.. 83
LISTA DEJTABELAS
TABELA 5.1 - Caracterizao das amostras de pele para pesquisa. 50
TABELA 5.2 - Mdia dos valores de espessura das amostras de pele (em mm) para os lotes irradiados a 25 kGy e 50 kGy. 51
TABELA 5.3 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em MPa) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do gnipo submetido ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy. 53
TABELA 5.4 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em porcentagem) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do grupo submetido ao feixe de eltrons com dose de 25 kGy. 54
TABELA 5.5 - Medidas centrais e de disperso do mdulo de elasticidade das amostras dos seis doadores para os grupos irradiados com gama e com eltrons (em proporo) a 25kGy. 56
TABELA 5.6 - Teste de significncia de "Student" para mdia do mdulo de elasticidade (E, em. MPa) dos gi'upos in-adiados com gama e com eltrons com dose de 25 kGy, comparados mdia do grupo controle. Nvel de significncia=l%. 57
TABELA 5.7 - Teste de significncia de "Student" para mdias do mdulo de elasticidade (E, em MPa) de todos os doadores nos grupos irradiados com gama e com eltrons com dose de 25 kGy, comparados mdia do grupo controle p. Nvel de significncia=l% (a
TABELA 5.14 - Temperaturas do ambiente e das amostras irradiadas a 25 kGy com resfriamento no sistema de transporte de bandeja no acelerador de eltrons. Dados apresentados em graus Celsius (C)e em porcentagem (%). 62
TABELA 5.15 - Temperaturas do ambiente e das amostras irradiadas a 25 kGy com resfriamento no sistema de transporte de bandeja no acelerador de eltrons. Dados apresentados em graus Celsius (C)e em porcentagem (%). 63
TABELA 5.16 - Medidas centrais e de disperso do mdulo de elasticidade das amostras dos oito doadores para os grupos submetidos ao feixe de eltrons (em proporo)em sistema de transporte de esteira e de bandeja, temperatura ambiente e com resfriamento. 65
TABELA 5.17 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em MPa) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do grupo submetido ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. 65
TABELA 5.18 - Valores da mdia do mdulo de elasticidade (em porcentagem) do grupo controle, do grupo irradiado com gama e do grupo submetido ao feixe de eltrons com dose de 50 kGy. 67
TABELA 5.19 - Medidas centrais e de disperso do mdulo de elasticidade (em proporo) das amostras dos trs doadores para os grupos irradiados com gama e com eltrons a 50kGy. 68
TABELA 5.20 - Teste de significancia de "Student" t para mdia do mdulo de elasticidade (E, em MPa) dos grupos irradiados com gama e com eltrons com dose de 50 kGy, comparados mdia do grupo confrole no irradiado. Nvel de significncia=5% (p
LISTA TfE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas.
AIEA - Agencia Internacional de Energia Atmica.
ANSI - American National Standard.
ASTM - American Standard Test Method.
BT-ICHC - Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clnicas.
CNEN/SP - Comisso Nacional de Energa Nuclear / So Paulo.
CTR - Centro de Tecnologa das Radiaes.
DNA - Deoxyribonucleic Acid (= cido desoxinibonucleico),.
FM - Faculdade de Medicina.
IAEA - International Atomic Energy Agency.
ICB - histituto de Ciencias Biomdicas.
DPEN - Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares.
LBM - Laboratrio de Biologia Molecular.
NBR - Norma Brasileira.
REG - Retculo Endoplasnitico Granular
USP - Universidade de So Paulo.
UV - ultra-violeta (radiao).
L I S T A DE SMBOLOS
A - rea.
cal - calora (unidade de medida de energa: 1 cal = 4,18 J).
^Co " cobalto-60 (istopo radioativo do ^^Co).
C - Graus Celsius (unidade de medida de temperatura).
E - mdulo de elasticidade.
s - alongamento.
Ae - variao do alongamento.
d - diferena das mdias.
F - fora.
Gy - gray (unidade de medida de dose absorvida: 1 Gy = 1 J/kg)
g - graus de liberdade.
Ho - hiptese de nulidade.
Hi - hiptese alternativa.
Hz - hertz (unidade de medida de freqncia).
,T - joule (unidade de medida de energia).
kCi - quilocurrie (unidade de medida de atividade: 1 Ci = 3,7x10' desintegraes/seg).
keV - quiloeltronvolt (unidade de medida de energa: 1 eV = 23.060 kcal/mol).
kGy - quilogray (10" Gy).
kGy/h - quilogray por hora (unidade de medida de taxa de dose absoi-vida).
kGy/s - quilogray por segundo (unidade de medida de taxa de dose absorvida).
kN - quilonewton (unidade de medida de fora: 10^ N).
kV - quilovolt (unidade de medida de energa: 10^ V).
L - comprimento.
M - molar (concentrao: n de moles do soluto dissolvidos em 1 L de soluo).
mA - mih ampre (imidade de medida de corrente eltrica).
MeV - milho de eltronvolt (10* eV).
MPa - megapascal (unidade de medida do mdulo de elasticidade; 1 MPa = 1 N/mm ) .
mm - milmetro (unidade de medida de comprimento).
mm^ - milmetro quadrado (unidade de medida de rea).
[im - micrmetro (unidade de medida de comprimento: 1 im = 10'^ mm).
N - newton (unidade de medida de fora).
n - nmero de amostras.
COWSSO m.l(M.l DE EMtRJA MUCLEAl-^SP-iPEN
mn - nanmetro (tmidade de medida de comprimento: 1 nm = 10'^ [im).
s - desvio padro,
s ~ varincia
a - tenso.
Aa - variao da tenso.
t - varivel do teste de significncia de Student.
3c - mdia das amostras.
17
1 I N T R O D U O
A pele, considerada o maior rgos do corpo humano, representa 16 % do peso
coiporal (Junqueira & Carneiro, 1995) e se constitui em eficiente barreira contra urna
variedade de agentes fsicos, qumicos e biolgicos, alm de participar de processos
homeostcos e fisiolgicos de regulao (Hlaeac, 1995).
Em fiino de sua importancia, extensas leses na pele comprometem a recuperao
do individuo. o caso, por exemplo, de queimaduras graves, extensas e promdas, que
destroem epidenne, derme e tecidos subcutneos impossibilitando a regenerao
espontanea da pele e muitas vezes levando o paciente a bito. A reduo da mortahdade
est relacionada, portanto, eficcia da proteo precoce da regio queimada de modo a
diminuir substancialmente a desidratao, possibilitar o controle de infeces (Hemdon,
1997) e permitir a regenerao adequada da pele, evitando a ocorrncia de retrao dos
tecidos adjacentes e fonnao de cicatrizes defoiTnantes (Borojevic & Semcella, 1999).
Para a maioria dos ferimentos causados por queimaduras, a melhor opo de
cobertura o enxerto antologo (tecido do prprio indivduo) pois pode ser permanente,
uma vez que no existe risco de rejeio imunolgica. No entanto, se a disponibilidade de
rea doadora para autoenxerto limitada, outros tipos de substitutos, sintticos ou
biolgicos, podem ser utizados (Sheridan & Tompkins, 1999).
Pesquisas com biomateriais tm desenvolvido e colocado no mercado substitutos
drmicos ou compostos dermo-epidrmicos sintticos, polimricos ou de origem biolgica,
destinados ao tratamento de queimados (Balasubramani et al. 2001; Rennekampff &
Schaller, 2002).
Entretanto, apesar dos avanos no campo da bioengenharia de tecidos, os
aloenxertos de pele ainda se mantm como "padro ouro" na cobertura temporria de
queimaduras extensas e profiindas (Mackie, 2001) e tm sido preferencialmente utilizados
nesses procedimentos, em detrimento dos curativos sintticos ou de biomaterias (Richters
et a l , 1996). Este fato est relacionado comprovada diminuio da mortahdade e do
sofrimento dos pacientes, s propriedades do aloenxerto em favorecer a re-epitehzao da
rea injuriada, e simplicidade do processo de conservao e manuteno da pele em
18
Bancos de Tecidos (Bolgiani & Benain, 1993; Mackie, 1997; Freedlander et a l , 1998;
Kearney, 1998; Bravo et al., 2000; Robb et al., 2001).
As principais crticas utilizao dos enxertos algenos, se referem ao estoque
limitado de tecidos (Hemdon, 1997) e ao risco de contaminao microbiolgica (Eastlimd,
1995; Kealey, 1997; Pimay et al., 1997). No entanto, Hemdon (1997) considera que a
disponibilidade de pele para enxerto pode ser otimizada com a divulgao e sensibilizao
pblica, dirigida ao aumento da captao de tecidos. Quanto segurana, o autor faz
referncia necessidade de normas especficas de controle de qualidade nos Bancos de
Tecidos.
Nesse sentido, a Agncia Internacional de Energia Atmica (AIEA), com sede em
Viena, tem contribudo para a criao de bancos de tecidos, na promoo de encontros,
fornecimento de suporte tecnolgico, elaborao e publicao de normas e padres
aplicveis esterilizao por radiao ionizante (Pedraza, 2003).
Os bancos de tecidos devem garantir a integridade e esterilidade dos tecidos
armazenados. Uma vez que os mtodos de processamento para conservao de tecidos
(congelamento, liofilizao e imerso em glicerol concentrado) podem no ser
esterilizantes, faz-se necessrio adicionar ao processo, mtodos de esterilizao (lAEA,
2002a), que, alm de confiveis, no alterem significativamente a morfologia destes
tecidos e mantenham suas caractersticas, o mais prximo possvel das do tecido fi-esco.
Assim como determinados produtos polimricos, tecidos biolgicos no podem ser
esterilizados pelo calor, pois em temperaturas acima de 56 C ocorre desnaturao de suas
protenas. A esterilizao por xido de etileno (EtO) requer monitorao, aerao e
quarentena, para remoo dos resduos do gs (lAEA, 2002a). Dziedzic-Goclawska &
Stachowicz (1997) so da opinio de que o EtO no deveria ser utilizado para esterilizao
de aloenxertos, principalmente devido aos efeitos txicos de seus resduos e dos produtos,
potencialmente cancergenos, resultantes da reao do gs com componentes orgnicos.
A radiao ionizante, por sua vez, apresenta uma srie de vantagens: no produz
resduos radioativos, no origina substncias txicas nem oferece riscos de contaminao
(por isso no h necessidade de quarentena); a estrutura dos tecidos e uma embalagem
adequada no interferem no resultado da esterilizao; a esterilizao pode ser feita na
temperatura de armazenamento e embalagem final; e sua confiabilidade considerada
excelente (Phillips, 1997).
Existem, entretanto, importantes diferenas no mecanismo de absoro de energia
pelos tecidos biolgicos, dependendo da fonte que utilizada: raios gama dos irradiadores
19
de ^Co ou feixes de eltrons gerados em aceleradores (Dziedzic-Goclawska &
Stachowicz, 1997). Essas diferenas e os efeitos do tipo de radiao ionizante, devem ser
estudados e conhecidos para a escolha da fonte de irradiao.
Os efeitos da radiao tambm variam de acordo com o tecido irradiado e como
este foi processado e armazenado.
Em tecidos biolgicos "ex vivo", destinados a enxerto, foram constatadas diferentes
alteraes na estrutura das molculas de colgeno, em amostras de ossos e tendes,
dependendo do tipo de conservao do tecido (congelado ou liofilizado) comparados ao
tecido fresco (Dziedzic-Goclawska, 2000).
Especificamente em relao pele, vrios estudos foram realizados sobre o efeito
da radiao ionizante no tecido "in vivo". Trott et al., (1999) {apud Schmuth et al., 2001),
constataram, em modelo animal, mudanas degenerativas da epiderme, morte das clulas
epiteliais, hipoplasia, inibio da proliferao celular e ocorrncia de apoptose na
epiderme. Schmuth et al. (2001), relataram a ocorrncia de alterao funcional na
permeabilidade do estrato crneo da epidenne humana nas dermatites por radiao, em
pacientes de radioterapia por ftons e por eltrons. Outras pesquisas "in vivo" realizaram
estudos morfomtricos em fibrilas de colgeno tipo I da derme irradiada de camundongos
por baixas doses de irradiao gama. Entre eles, Leontiou et al. (1993) descreveram o
aumento de dimetro das fibrilas de colgeno, e Tzaphlidou et al. (2002), verificaram a
modificao da arquitetura da fibrila de colgeno na derme irradiada com raios gama.
A degradao do colgeno modifica suas propriedades biomecnicas (Olde Damink
et al., 1995) e conseqentemente interfere nas caractersticas biomecnicas da pele, uma
vez que essa protena fibrosa, inelstica e flexvel da derme responsvel pela integridade
e resistncia s tenses multi-direcionais a que o tecido pode ser submetido (Ottani, 2001).
O trabalho que a AIEA tem desenvolvido, resultou no criao de programas
nacionais de bancos de tecidos que utilizam a radiao ionizante para a esterilizao de
tecidos em pelo menos trinta pases, dentre os quais, o Brasil (Pedraza, 2003).
O Instituto Central do Hospital das Clnicas (ICHC) da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo (FM-USP) em convnio com o Instituto de Pesquisas
Energticas e Nucleares (IPEN-CNEN/SP), e financiado pela AIEA, implantou em 2000, o
primeiro Banco de Tecidos no Brasil, a utilizar radioesterilizao em tecidos conservados
em glicerol concentrado (mnimo 85%), para transplantes algenos, proporcionando a
20
viabilizao de estudos e avaliao dos tecidos submetidos a esse processo (Bourroul et al.,
2002).
Durante o binio 2001-2002, especialistas de diferentes reas do Programa de
Radiao e Bancos de Tecidos, prepararam os seguintes documentos, concludos em
agosto de 2002, que regulamentam o funcionamento dos bancos de tecidos e a utilizao
da radiao ionizante como mtodo esterilizante:
1. Padres internacionais em bancos de tecidos;
2. Cdigo de prticas para esterilizao por radiao de tecidos para aloenxerto;
3. Estratgias de conscientizao pblica para bancos de tecidos.
Para 2003-2004, um dos maiores objetivos do programa ser o de promover a
utilizao desses docimientos pelos pases participantes (lAEA, 2004).
2 OBJETIVOS
Em funo do que foi exposto, os principais objetivos deste trabalho foram:
> Avaliar os efeitos da radiao na pele conservada em glicerol concentrado por meio da
caracterizao do tecido quanto morfologia e resposta aos ensaios de resistncia
trao.
> Estabelecer procedimentos de utilizao de duas fontes distintas de radiao ionizante
para esterilizao de pele humana destinada ao aloenxerto: irradiador de ^Co e
acelerador de eltrons.
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3 CONSIDERAES GERAIS
3.1 A PELE HUMANA
3.1.1 Funes
A pele, cuja espessura varia de 0,5 mm a 6,0 mm, reveste externamente o corpo
humano, garante a proteo do indivduo e sua interao com o meio circundante.
formada por duas camadas, epiderme e derme.
A pele ntegra uma efetiva barreira contra invaso de microorganismos, ao de
toxinas, traumas mecnicos, temperaturas extremas e baixas doses de radiao ionizante
(Schmuth et al., 2001). A proteo do organismo contra os efeitos prejudiciais dos raios
solares, especialmente dos ultra-violeta, se deve pigmentao da pele fornecida por
grnulos de melanina que, produzidos pelos melancitos, so transferidos aos
queratincitos (Junqueira & Carneiro, 1995).
Exposta ao meio ambiente, a pele capaz de responder s modificaes externas e
internas. E responsvel pela manuteno dos processos homeostticos, participa da
termorregulao corporal, dos equilbrios hdrico e osmfico, e dos processos fisiolgicos
de regulao, como na sntese de vitamina D \ colesterol e melanina (Hlaeac, 1995;
Schmuth et al., 2001). Possui um complexo sistema antioxidante, que inclui componentes
enzimticos e no enzimticos, constituindo-se na primeira defesa contra radicais livres
(Pugliese, 1998). A sensibilidade sensorial e percepo do meio extemo est relacionada s
inmeras terminaes nervosas, neurorreceptores, localizados na derme. A resposta
imunolgica da pele aos alrgenos, ocorre graas aos linfcitos presentes na derme e s
clulas apresentadoras de antgenos da epiderme (Junqueira, 1995).
A pele possui anexos - pelos, unhas, glndulas sudorparas e sebceas - com
funes protetoras especializadas (Kerr, 2000).
Danos ou perda de grandes reas de pele, tais como queimaduras extensas, podem
causar severas alteraes sistmicas, tais como, hipotermia, perda de fludos, infeces, ou
ainda, cicatrizes e alteraes na imagem corporal, ou at mesmo acarretar a morte do
indivduo. (Hlaeac, 1995; Kofler, 2001).
'A vitamina D atua no metabolismo do clcio, promovendo sua absoro pelo epitelio intestinal e reduzindo a secreo de Ca*^ pelos rins).
22
3.1.2 Morfologa :
Anatmicamente, a pele formada por duas camadas, epiderme e derme, com
caractersticas e origem embrionaria distintas, mas que possuem uma grande adeso e
interatividade. Abaixo da derme, a hipoderme formada por tecido adiposo e no faz parte
da pele; constituindo-se em tecido subcutneo de suporte e unio com os rgos
subjacentes (Junqueira & Carneiro, 1995; Herson, 1999; Kerr, 2000,).
A caracterizao das camadas da pele j foi amplamente estudada e aparece na
maioria dos artigos que abordam o assunto e nos livros-texto de histologa e dermatologia.
As descries sintticas da epiderme, membrana basal e derme, abaixo descritas, foram
baseadas em Junqueira & Carneiro (1995); Holbrook & Wolff (1999); Kerr (2000) e Koller
(2001).
3.1.2.1 Epiderme
A epiderme, que constitui a interface com o meio externo, formada por tecido
epitelial estratificado pavimentse queratinizado de origem ectodrmica com pouqussima
matriz extracelular. Geralmente muito delgada na maior parte do corpo (no ultrapassando
0,12 mm), toma-se mais espessa nas reas de constante presso e atrito, tais como solas
dos ps e palmas das mos. considerada o componente mais ativo da pele pois, medida
que a camada crnea, mais superficial, sofre descamao, constantemente substituda por
novas clulas originadas das camadas mais profimdas.
A epiderme composta por cinco camadas. As caractersticas de cada uma refletem
as propriedades mitticas e sintticas dos queratincitos e seu estgio de diferenciao:
1. Camada cmea: Formada por escamas comeas, que perderam ncleo e organelas, mas
que permanecem aderidas umas s outras e so preenchidas por queratina. Essa camada
impermevel, resistente s presses mecnicas e ao cisalhamento, s mudanas de pH e de
temperatura e digesto enzimtica. medida em que se desprendem, as escamas so
continuamente repostas por queratincitos da camada lcida.
2. Camada lcida: Ausente nas regies onde a pele mais fina, possui intensa atividade
enzimtica.
3. Camada granulosa: Os queratincitos acumulam queratohialina, protena que est
provavelmente relacionada rigidez da clula que est morrendo. Essa camada tambm
responsvel pela sntese de involucrina que exocitada acumula-se sobre as clulas
promovendo a impermeabilizao do epitelio, garantindo o equilbrio hdrico e
homeosttico do organismo.
23
4. Camada espinhosa: As clulas possuem tonofibrilas (feixes de filamentos de
citoqueratina) que juntamente com os desmossomos mantm a coeso entre as clulas e
conferem resistncia ao atrito.
5. Camada basal ou germinativa: A camada basal possui clulas indiferenciadas que
apresentam intensa atividade mittica originando continuamente os queratincitos,
medida que as clulas amadurecem, so empurradas para as camadas mais superficiais,
diferenciam-se e assumem novas funes.
3.1.2.2 Membrana Basal
A membrana basal estrutura identificada no microscpio ptico, composta pela
lmina basal (observada somente no microscpio eletrnico) e parte da matriz extracelular
da derme adjacente. A lmina basal presente no contato entre epiderme e derme,
produzida por ambas as camadas. As protenas transmembrnicas das clulas epitehais
mantm interao com as fibrilas de colgeno produzidas pelos fibroblastos, o que garante
a adeso e continuidade fsica entre as duas camadas (Alberts et a l , 1997).
A interface entre derme e epiderme papilar, o que aumenta a superfcie de contato
entre elas e permite que a pele estique sem romper .
3.1.2.3 Derme
A derme, camada mais profunda da pele, constituda por tecido conjuntivo de
origem mesodnuica, onde h maior quantidade de matriz extracelular do que clulas. A
matriz extracelular formada por grande quantidade de substncia amorfa, representada
pelos proteoghcanos, e um integrado sistema de fibras de colgeno e elastina produzidas
pelas clulas do conjuntivo, os fibroblastos. Essa camada garante a integridade fsica da
pele e tambm participa de sua regenerao.
Na derme encontram-se os vasos sangneos e linfticos que irrigam e nutrem a
epiderme, assim como os neurorreceptores que percebem estmulos tteis, variaes de
temperatura e sensaes dolorosas. Presentes nessa camada esto tambm estruturas da
epiderme como os folculos pilosos e as glndulas sebceas e sudorparas (Holbrook &
Wolf, 1999).
A derme distingue-se em duas regies: derme papilar (poro superior da derme,
adjacente epiderme) e derme reticular (regio mais profunda).
A derme papilar irregular na regio de interdi girt ao com a epiderme. E
constituda por tecido conjuntivo frouxo, fibras reticulares, fibras do sistema elsticos
24
(oxitalnicas) e muitas alas capilares. Continuamente regio papilai^ a camada reticular
da derme formada por tecido conjuntivo denso no modelado com fibras colgenas
firmementeagrupadas em feixes e fibras elsticas espessas (Gartner & Hyatt, 2001).
3.1.2.3.1 Fibras Colgenas
O colgeno constitui a famlia de protenas mais abundante nos vertebrados
superiores (Lehninger, 1976) compreendendo cerca de 25% das protenas totais do
organismo (Gartner & Hyatt, 2001). Dos 15 tipos de molculas de colgeno conhecidos, os
freqentemente encontrados nos tecidos conjuntivos so os tipos I, II, III, V e XI, sendo
todos de estrutura fibrilar (Alberts, 1997). O principal componente fibroso da derme o
colgeno tipo I, protena insolvel (Stryer, 1996), que corresponde a cerca de 75% da pele,
em peso seco. As fibras de colgeno, formadas por colgeno I, esto presentes na derme
reticular e so responsveis pela resistncia do tecido s foras de tenso. As fibras
reticulares, mais finas, so formadas por colgeno tipo III e encontram-se na regio papilar
da derme (Holbrook & Wolff, 1999).
Para reconhecer o tpo de estrutura que se observa no microscpio ptico e no
microscpio eletrnico de transmisso, necessrio entender a sntese das fibras de
colgeno.
A molcula de colgeno formada por uma tripla hlice a partir de 3 cadeias alfa
que se enrolam umas nas outras formando um tipo de corda supertorcida. Uma cadeia alfa-
hlice a estrutura secundria de um polipeptdeo formado por vrias subunidades
semelhantes, no qual um aminocido se liga com o quarto aminocido da cadeia, dando
uma volta em si mesmo. Cada cadeia de alfa-colgeno possui cerca de 1000 aminocidos e
contm 3 aminocidos por volta onde o 3 sempre ghcina (Gly) na seqncia: X-Y-Gly,
onde X e Y podem ser quaisquer aminocidos mas geralmente X prolina e Y
hidroxiprolina. O fato da Gly ser o menor aminocido da natureza (pois seu radical
apenas constitudo pelo hidrognio), que mantm as 3 cadeias alfa prximas, pois ele
ocupa o interior da molcula (FIG.3.1).
25
FIGURA 3.1 - Representao da molcula de colgeno formada por 3 cadeias alfa. O aminocido glicina est indicado em cor mais forte na regio interna da molcula (modificado de Alberts, 1997).
A sntese de colgeno se inicia no retculo endoplasmco granular (REG) onde so
formadas as 3 cadeias-alfa (cada uma possui um peptdeo de sinal na poro terminal da
molcula). Algumas prolinas e lisinas da cadeia a so hidroxiladas (insero do anion OH
nesses aminocidos) auxiliadas pelo co-fator vitamina C no Complexo de Golgi. Na falta
de vitamina C, a tripla hlice fica frgil e os tecidos conjuntivos no se mantm ntegros.
Cada cadeia alfa combina-se com duas outras formando uma molcula helicoidal de tripla
fita Ugada por pontes de hidrognio (H) e denominada de pr-colgeno. O pr-colgeno
lanado para fora do REG em vescula secretora que leva a molcula para o meio
extracelular. No meio extemo recebe o nome de tropocolgeno. Aps serem secretados
pelos fibroblastos, as molculas de colgeno agmpam-se em polmeros ordenados,
denominados fibrilas de colgeno, graas remoo da seqncia final da molcula de
colgeno (peptdeo de sinal ou pr-peptdeo), pela enzima colagenase sintetizada pelos
prprios fibroblastos. O peptdeo de sinal tem a funo de guiar a formao intracelular da
fita tripla e impedir a formao de fibrilas dentro da clula. As fibrilas de colgeno
normalmente se agregam em fibras de colgeno. As fibras de colgeno se agregam em
feixes de colgeno (Alberts, 1997). As fibras e feixes de colgeno podem ser observados
no microscpio ptico. As fibrilas de colgeno podem ser individuazadas somente no
microscpio eletrnico. A FIG.3.2, sintetiza o que foi descrito.
26
feixe
^^0=1 fibra fibrila
regio de superposio
tropocolgeno
regio lacunar
FIGURA 3.2 - Estrutura da fibra de colgeno: as fibras de colgeno so formadas por unidades menores, as fibrilas, constituidas por macromolculas denominadas tropocolgeno que esto paralelamente organizadas. O tropocolgeno formado por trs cadeias peptdicas de estrutura alfa- ligadas por pontes de hidrognio (modificado de Gartner & Hyatt. 2001).
A estrutura da molcula proteica de colgeno mantida, em grande parte, graas s
pontes de hidrognio que mantm a estrutura da alfa-hlice e est presente entre molculas
alfa-hlice, formando a molcula tripla-hlice (FIG.3.3). Esse tipo de ligao ocorre devido
ao aspecto altamente eletronegativo do tomo de oxignio, que em ligao covalente com o
hidrognio, tende a atrair o seu nico eltron. O hidrognio assume carga positiva parcial
local, enquanto que o oxignio fica com carga negativa parcial local na zona das rbitas
no compartilhadas. Na regio em que pores de molculas se aproximam muito ocorre
atrao eletrosttica entre a carga negativa parcial do tomo de oxignio de uma poro da
molcula e a carga positiva parcial do tomo de hidrognio ligado covalentemente a outro
tomo eletronegativo. Essa unio eletrosttica denominada ponte de hidrognio
(Lehninger, 1976).
27
Pontos de hidfngpnio iniertvidow
QO Oo c O ViM,i (lo.ill.i
FIGURA 3.3 - Pontes de hidrognio na molcula de colgeno: (A) entre tomos que formam a alfa-hlice (intra-molecular); (B) entre as trs molculas alfa que formam o tropocolgeno (intermolecular), (modificadas de Lehninger, 1976).
As pontes de hidrognio nas molculas proteicas so relativamente fracas se
comparadas s ligaes covalentes. A ttulo de comparao, a ponte de hidrognio entre O
e H tem uma energia de ligao'^ de 4,5 kcal/mol enquanto a ligao covalente entre O e H
possui uma energia de ligao de 110 kcal/mol. Num sistema aquoso, como nos tecidos
biolgicos, as molculas de gua competem para formar pontes de hidrognio com as
molculas de protena. Por outro lado, a formao da primeira ponte de hidrognio entre
molculas de peptdeos, por questes geomtricas, favorece muito a formao da segunda
ligao, esta segunda ligao aumenta a probabilidade de se formar uma terceira, e assim
por diante, resultando numa ligao muito forte entre duas ou mais cadeias peptdicas. Essa
facilitao de formao de pontes de hidrognio chamada de cooperatividade,
caracterstica das molculas proteicas que podem conter at milhares de ligaes
cooperativas de pontes de hidrognio (Lehninger, 1976).
Alm das ligaes por ponte de hidrognio, j citadas, o reforo intra e
intermolecular tambm dado por ligaes covalentes cruzadas entre as lisinas que
compe as molculas de colgeno. Se a ligao cruzada inibida, a fora tensora das
fibrilas reduz e o tecido toma-se frgil (Alberts, 1997; Stryer, 1992).
possvel identificar o colgeno com coloraes especficas, em lminas
histolgicas. A colorao com tricromo de Mallory, por exemplo, comumente utilizada
C(MSSO W!CIOM\L D EUEHm ^SJCLEAR/SP-IPEN
28
para diferenciao entre fibras de colgeno e fibras musodares, entretanto, no apresenta
resultados satisfatrios para distino entre os tipos de colgeno (Montes, 1996).
Montes (1996) afirma que o mtodo picrosirius um processamento histoqumico
especfico para deteco de colgeno em cortes histolgico. As molculas de colgeno
possuem uma orientao paralela, uma em relao s outras, que lhe conferem uma
birrefringncia natural. O corante "sirius red" alinha-se paralelamente ao longo eixo de
cada uma das molculas, realando sua birrefringncia; a incidncia de luz polarizada cria
uma imagem brilhante e colorida das fibras de colgeno que se destacam de outras
estruturas no orientadas. Pela diferena de intensidade e cor, possvel distinguir os tipos
de colgeno do tecido observado. Assim, o colgeno tipo I forma fibras espessas {fibras
colgenas) que apresentam intensa birrefiingncia de colorao amarela ou vermelha. O
colgeno tipo III forma fibras finas {fibras reticulares) frouxamente dispostas e por isso
apresentam birrefringncia esverdeada
Estudos de microscopia eletrnica mostram o colgeno tipo I como grossas fibras
formadas por uma srie de fibrilas densamente empacotadas. Observadas no microscpio
eletrnico de transmisso, as fibrilas de colgeno apresentam estriaes transversais
caractersticas a cada 67 mn, o que reflete a alternncia regular das molculas de colgeno
(tropocolgeno) paralelamente ordenadas na fibrila (FIG. 3.2). O corante penetra na regio
lacimar, preenchendo o espao entre as molculas e formando bandas coradas fortemente
(Alberts, 1997). Stryer (1996) atenta para o fato de que as fileiras de tropocolgeno no
esto em fase, indicando que as fileiras adjacentes esto deslocadas de aproximadamente
67 nm. Em recente estudo Tzaphhdou (2004) descreve a no uniformidade das bandas mas
a ocorrncia de 12 bandas de diferentes espessuras, denominadas "perodo D".
3.1.2.3.1 Fibras Elsticas
Uma rede de fibras elsticas na derme fornece a elasticidade pele, de tal modo que
aps uma distenso temporria, o tecido volta conformao original. O principal
componente das fibras elsticas a elastina, protena hidrofbica rica em prolina e lisina
(assim como o colgeno). Alberts (1997) descreve a formao das fibras elsticas e seus
trs tipos: oxitalnicas, elaunnicas e elsticas. Existe uma aumento de complexidade da
fibras oxitalnica para a elstica. A fibra oxitalnica constituda apenas por microfibrilas
agrupados; a elaunnica apresenta substncia amorfa (elastina) entre as microfibrilas e as
fibras elsticas apresentam um cerne de elastina circundado por microfibrilas (Alberts,
^ Energia de ligao a energia necessria para romper uma ligao entre os, tomos.
29
1997; Gartner & Hyatt, 2001). Existe uma continuidade entre as fibras elsticas,
elaunnicas e oxitalnica, da regio mais profimda da derme at a regio papilar.
Montes (1996), descreve os principais mtodos de colorao para fibras elsticas,
que so precedidos por digesto com elastase. Entre esses mtodos, a colorao por
resorcina-fiicsina de Weigert a mais sensvel e ainda cora fibras elaunnicas. As fibras
oxitalnicas so coradas quando previamente feita uma oxidao com oznio
aquoso 10%.
Ao mVel ultraestrutural, as fibras elsticas compreendem um cerne com abundante,
homogneo e amorfo material rodeado de microfibrilas.
3.1.3 Caracterizao Biomecnica da Pele Humana
As caractersticas biomecnicas da pele so determinadas principalmente pela
direo e resistncia apresentadas pela rede de colgeno da derme mais profunda e pelas
fibras oxitalnicas locahzadas na derme papilar. Biomecnicamente, a pele no se
comporta como um material homogneo. Segundo Gibson (1967), a anUse de uma lmina
histolgica de pele que foi fixada em estado relaxado, mostra fibras colgenas dispostas
aparentemente ao acaso. No entanto se a pele mantida distendida durante a fixao, as
fibras apresentam-se orientadas no sentido do alongamento; quanto maior a fora a que a
pele submetida, maior a quantidade de fibras colgenas alinhadas. Submetidas baixa
tenso, as fibras de colgeno deslizam com relativa facilidade umas sobre as outras e a pele
distende. medida em que as fibras tomam-se alinhadas, a resistncia contra o
estiramento aumenta e necessrio aplicar uma fora maior, que acaba provocando a
deformao do tecido e, finalmente, seu rompimento.
Recentemente, Noorlander (2002) desenvolveu um mtodo para determinar
mudanas mensurveis na orientao das fibras colgenas na derme resultantes de tenses
mecnicas. Baseando-se em mtodo descrito por Junqueira (1979) opw/Noorlander (2002)
de colorao com picrosirius e observao com microscpio de epipolarizao, o autor
converte imagens digitais em imagens binarias que so analisadas quantitativamente.
A epiderme tambm contribui para a caracterizao biomecnica da pele. Chistolini
(1999) sugere que a fora biomecnica da epideraie devida s junes adesivas
intercelulares e reao tenso oferecida pelo citoesqueleto, En-e os queratincitos
estabelecem-se junes adesivas (desmossomos) que mantm as clulas muito unidas
mesmo quando morrem, as escamas comeas permanecem aderidas superfcie do epitelio
por causa das junes adesivas.
30
Os estudos biomecnicos podem ser realizados em equipamentos especicos. A
Mquina Universal de Ensaios Instron, modelo 5567, do CTR/DPEN possui cmara para
ensaios a temperaturas de -70C a 250C, mdulos de carga de 1 kN e de 10 kN e conjunto
de garras adequadas para materiais rgidos, semi-rgidos e no rgidos. Possui tambm
sistema pneumtico de ajuste de garras para fixao das amostras. Na Mquina Universal
de Ensaios Instron, podem ser realizados ensaios de trao, compresso e flexo. (FIO.3.4).
O sistema de comando e aquisio de dados composto por microcomputador PC e
programa Merlin 2.21, e impressora matricial.
FIGURA 3.4 -Mquina Universal de Ensaios Instron.(A) Aspecto geral , controles e sistema computacional. (B) Garras segurando corpo de prova..
3.2 ALOENXERTO
A possibilidade de armazenamento de pele humana para posterior aproveitamento
como enxerto no recente. Desde o inicio do sculo XX, vrios so os registros de
estudos do desenvolvimento de diferentes mtodos de conservao.
PHILLIPS (1997) alirma serem o congelamento, a liofilizao e a imerso em
glicerol concentrado, os principais mtodos de conservao utilizados em Bancos de
Tecidos A retrigerao mtodo freqentemente empregado para conservao de
autoenxertos, no sendo apropriado para armazenagem de enxertos por longo tempo pois a
viabilidade da pele no refrigerador de apenas 14 dias.
No processo de congelamento so empregadas substancias crioprotetoras como o
glicerol em baixas concentraes (de 5% a 30%) que promovem uma diminuio do ponto
de congelamento da soluo. Os crioprotetorea ajudam a diminuir a formao de cristais de
gelo, que so muito prejudiciais viabilidade das clulas cutneas. A pele congelada deve
31
ser armazenada em freezer -80C e para sua utilizao^deve-se proceder a um rpido
descongelamento e inativao do crioprotetor (Phillips, 1997).
A liofdizao um mtodo de conservao bastante utilizado pois inativa as
enzimas que provocam autlise das clulas logo aps sua morte, sem porm, desnaturar as
protenas, garantindo as propriedades estruturais importantes do enxerto. Nesse processo
combina-se congelamento e secagem a vcuo, durante o qual a gua removida da clula
no estado congelado. (Gava, 1979). Tecidos biolgicos liofilizados devem ter um contedo
de umidade residual menor do que 5%, podem ser mantidos temperatura ambiente,
reidratam-se facilmente e mantm sua estrutura inicial. (Phillips, 1997). Ainda que inative
algumas formas vegetativas de microorganismos, como alguns tipos de fungos e bactrias,
que necessitam de nveis de umidade ao redor de 30% para desenvolver suas atividades
metablicas (Gava, 1979), a liofihzao no esteriliza os tecidos (IAEA, 2002'*).
O glicerol em altas concentraes (acima de 85%) pode ser utilizado como
conservante de tecidos biolgicos a longo prazo (Pigossi et al., 1971) . Ao desidratar a
pele, o glicerol preserva sua estrutura, pois substitui a gua extrada das clulas e distribui
a gua remanescente pelo tecido (Marshall, 1995; Richters, 1996). Alm disso, no afeta as
fibras de colgeno e elastina presentes na derme (Richters, 1996). Aliado simplicidade
tcnica da conservao, o glicerol apresenta ainda ao bacteriosttica comprovada
(Baare,1994; Marshall, 1995). Os autores recomendam, porm, a utilizao dos enxertos
somente aps, no mnimo, quatro semanas, para garantir a efetividade do processo. A
utilizao de um mtodo de esterilizao aliada conservao em glicerol contribui, entre
outras vantagens, para diminuir o tempo de quarentena dos enxertos.
Os tecidos adequadamente conservados so armazenados em Bancos de Tecidos.
Em So Paulo, o Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clnicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (BT-ICHC) referncia na
conservao e armazenagem de pele humana destinada a aloenxerto.
Herson (2004) descreve os procedimentos e os rgos responsveis pela seleo de
doadores, os critrios para aceite ou recusa do doador (entre eles os resultados da sorologia
e microbiologia), a retirada com dermtomo eltrico e avaliao do tecido.
Resumidamente, so considerados doadores para transplante de pele, idivduos
entre 15 e 60 anos dos quais se conhece os antecedentes mdicos, em morte cerebral
(considerados tambm doadores de rgos) ou doadores cadver aps parada cardaca. A
disponibilizao de tecidos humanos para transplante foi regulamentada no Brasil pela Lei
n 9.434 (1997), cujo contedo estabelece critrios para a retirada de tecidos de doadores in
,A0 !#JO*L D Wmh NUCLE'lR/SP-iPEf'
32
vivo ou post mortem ('precedida de morte enceflica) para transplante ou outras
modalidades de tratamento.
So excludos como doadores os portadores de: doenas autoimunes; enfermidades
malignas (cncer, carcinoma, leucemia, linfoma, sarcoma., nevus malignos, nevus
mltiplos benignos); doenas transmissveis bacterianas ou virais, tais como: tuberculose,
Aids, hepatite, doenas venreas. Outras manifestaes que excluem o doador, podem ser:
infeces na pele, dermatites, leses inflamadas ou abrases na rea; intoxicaes por
agentes qumicos. Tambm no so aceitos como doadores, os indivduos que tenham
pertencido a grupos de risco quanto ao comportamento sexual promscuo, consumidores de
drogas injetveis e tatuados (a menos de 12 meses). Por meio dos exames sorolgicos do
doador, podem ser detectadas patologias no diagnosticadas.
A pele destinada pesquisa no caso de resuhados desfavorveis da triagem ou dos
testes microbiolgicos e sorolgicos.
3.3 ESTERILIZAO
O conceito de esterilidade refere-se inativao ou destruio de microorganismos
capazes de reproduo. O nvel de eficcia obtido com determinado processo esterilizante
aceito para itens que apresentem a probabilidade de serem no estreis, a um nvel de
garantia de esterilidade ou Sterility Assurance Levei (SAL) igual ou superior a 10'^. "Esta
definio de esterilidade, como funo probabilstica, no significa porm inferir que se
admita a no esterilidade de um em cada milho de unidades e sim agregar cuidados
adicionais que efetivamente, permitam o emprego seguro do produto" (Pinto, 2000).
3.3.1 Esterilizao por Radiao Ionizante
A inativao de microorganismos por agentes esterihzantes envolve dano
irreversvel de molculas essenciais clula (DNA, protenas). Da mesma forma, a
exposio a estes agentes pode provocar danos ao tecido (Pinto, 2000).
Tecidos biolgicos no podem ser esterilizados pelo calor em funo da
desnaturao de suas protenas; a utilizao de xido de etileno tambm no
recomendvel pois libera resduos txicos que ficam impregnados no tecido.
A radiao ionizante, de acordo com Phillips (1997), apresenta imia srie de
vantagens como agente esterilizante de tecidos biolgicos, quando comparada aos mtodos
33
tradicionalmente utilizados para esterilizao de produtos mdico-hospitalares (citados
acima):
> no produz resduos radioativos, no origina substncias txicas nem oferece riscos de
contaminao;
> a estrutura do tecido no interfere na esterilizao;
> os tecidos podem ser esterilizados na embalagem final e temperatura de
armazenamento;
> no h necessidade de quarentena e a confiabilidade excelente.
Os princpios adotados no cdigo de prticas para a esterilizao de tecidos
destinados aloenxerto por radiao ionizante, so similares queles usados para
esterilizao de produtos para cuidados com a sade (lAEA, 2002b), isto , a referncia
normativa para o estabelecimento da dose esterilizante a ISO 13409 (1996), que
estabelece 25 kGy a dose esterilizante. Entretanto, os vrus so mais radiorresistentes do
que outros microorganismos e para garantir a esterilidade nos casos de contaminao viral
necessrio irradiar os tecidos com doses mais elevadas. Sulvan (1971) encontrou
valores de dose entre 35kGy e 48kGy para inativao de vrus irradiados em suspenso de
meio mnimo Eagle.
O efeito da radiao ionizante nos tecidos vivos bem conhecido. Especificamente,
a radiao gama altera o colgeno tipo I da derme em sua estrutura molecular e ocorre
aumento da fireqncia de formao de feixes anormais (Tzaphlidou, 2002).
Em tecidos para aloenxerto, estudos realizados com amostras de tendes e ossos
"firescos", indicam que radicais Uvres (principalmente OH) formados pela radilise da gua
disponvel nos tecidos, promovem 'cross-linking' (ligaes cruzadas) entre as molculas de
colgeno, tomando-as mais unidas. A ciso das cadeias de polipeptideos do colgeno
ocorre predominantemente quando o ossos e tendes so irradiados em amostras
Ik^lizadas, onde no h disponibilidade de gua no tecido (Dziedzic-Goclawska, 2000).
3,4 RADIAO IONIZANTE
A absoro de energia da radiao nos materiais pode induzir a uma excitao ou
ionizao. O aumento do nvel de energia de um eltron em um tomo ou molcula sem
sua ejeo denominado excitao. Se a radiao tem suficiente energia para ejet-lo a um
ou mais orbitais do tomo, o processo denominado ionizao, e esta radiao dita
radiao ionizante. As radiaes ionizantes podem ser emitidas por elementos com ncleos
34
atmicos instveis ou produzidas em equipamentos conhecidos como fontes intensas de
radiao (Spinks, 1990). As radiaes ionizantes so classificadas em eletromagnticas e
particuladas.
A seguir, sero caracterizadas apenas os tipos de radiao que sero utilizadas no
processamento das amostras neste trabalho (a caracterizao de todos os tipos de radiao
ionizante podem ser encontrados em Spinks, 1990).
3.4.1 Radiao Gama
Os raios gama so emitidos por istopos radioativos; representam o excesso de
energia que lanada pelos ncleos instveis que decaem para formar elementos estveis
(Hall, 1994). So radiaes eletromagnticas de origem nuclear, com pequeno
comprimento de onda, monoenergticas ou com ura pequeno nmero de energias discretas.
O ^Co, por exemplo, emite ftons de energia igual a 1,332 e 1,173 MeV.
Os raios gama tendem a perder a maior parte de sua energia em uma nica coliso. O
resultado que quando uma frao dos raios gama colide com a completamente
absorvida mas os ftons restantes so transmitidos com sua energia inicial total.
No caso do ^Co a interao da radiao com a matria se d, principaknente pelo
efeito Compton, no qual um fton interage com um eltron livre ou com um eltron
fracamente ligado a um tomo. Uma parte da energia do fton incidente transmitida ao
eltron que acelerado e ionizado; a outra parte da energia utilizada na criao de um
outro fton, com energia menor que a do fton incidente.
A energia total transferida pela absoro Compton, em qualquer volume,
diretamente proporcional densidade eletrnica do meio irradiado. O efeito Compton
predomina para energias de ftons entre 1 e 6 MeV. O efeito Compton pode ser tratado
como um choque elstico entre o fton e o eltron (HALL, 1994).
3.4.2 Feixe de Eltrons
Os eltrons so partculas muito pequenas e leves, com carga negativa.
Os feixes de eltrons podem ser produzidos por Aceleradores Industriais de Eltrons,
por um ctodo aquecido, por onde passa uma alta corrente que provoca uma sada de
eltrons do material. Esses eltrons so acelerados por uma diferena de potencial aplicada
entre o ctodo e o nodo. A formao dos feixes de eltrons est condicionada ao
funcionamento dos aceleradores. Uma vez desligado o aparelho no h emisso de
Omskj HKiOt^i ENER%.! P4LIC.LEA.R/SP-IPEM
eltrons. O feixe de eltrons possui alta taxa de dose porm com baixo poder de penetrao
na matria.
O feixe de eltrons monoenergtico, e por meio da variao do potencial aplicado
acelerao dos eltrons possvel variar a energia cintica dos mesmos aumentando seu
poder de penetrao. A trajetria do eltron no linear; os eltrons so desviados e
seguem um caminho em "zig-zag" conforme vo perdendo energia para a excitao
eletrnica ou ionizao dos tomos, de tal forma que o alcance menor do que a trajetria.
Os eltrons podem provocar diversos eventos ao longo de sua trajetria. Em
materiais, cuja densidade prxima a 1,0 (pele humana, por exemplo), a dose aumenta nos
primeiros centmetros de profundidade em decorrncia do aumento do nmero de eventos,
devido aos eltrons secundrios. Imediatamente abaixo da superfcie um pequeno volume
do material, interage com os eltrons secundrios gerados do feixe primrio de eltrons na
regio e fora da regio por espalhamento. Desse modo, os tomos do material interagem
com eltrons retro-espalhados vindos de todas as direes. Um pouco mais abaixo da
superfcie o nmero de eltrons secundrios cai, assim como o feixe primrio atenuado
(Spinks, 1990).
3.4.3 Efeito Direto e Efeito Indireto da Radiao Ionizante
A aherao qumica de uma macromolcula, cujos eltrons foram ejetados
ocasionada por colises com partcula carregada de alta energia ou atravs da ionizao
direta por ftons. Este efeito denominado efeito direto da radiao ionizante. O efeito
indireto devido aos radicais hvres e molculas muito reativas produzidos pela radiao
em meio aquoso (Biral, 2002).
Alexander (1967) descreve de maneira bem completa, as interaes, atravs dos
efeitos direto e indireto, da radiao iorzante com as macromolculas biolgicas.
3.5 FONTES DE RADIAO IONIZANTE
3.5.1 Irradiador de Cobalto 60 ( "Co)
As fontes de ^Co so fontes seladas que apresentam o ncleo radioativo de cobalto
em um compartimento hermeticamente fechado, que no tem contato direto com os
materiais externos. O ^Co utilizado nas fontes de irradiao produzido pela irradiao do
de ^^Co, istopo estvel, sendo formado por uma reao de captura de 1 nutron.O ^Co
decai com uma meia-vida de 5,27 anos para o istopo estvel ^Ni: pCo Ni + e'
36
O decaimento caracterizado pela emisso de dois ftons gama, com energias de
1.17MeV e l,33MeV, com eficincia de aproximadamente 100% para os dois ftons, e
emisso de partcula p, que no atinge o material a ser irradiado pois barrada pela
blindagem da fonte.
O irradiador GammaceU-220, do Centro de Tecnologa das Radiaes do Instituto de
Pesquisas Energticas e Nucleares (CTR-IPEN/SP), possui 48 lpis de ^Co de 20cm de
altura que circundam internamente a cmara primaria totalmente isolada; essa disposio
do material radioativo garante uniformidade de dose numa altura de 10 cm do material pois
as regies superior e inferior do cilindro recebem uma dose 15% menor. As amostras so
colocadas na cmara secundria, com dimenses limitadas a altura de 20.47 cm e dimetro
de 15.49 cm^, e volume total de 3,9 litros. A cmara secundria desce at a meia altura da
fonte por um sistema de elevador numa velocidade de 2.8 seg. Dentro da cmara
secundria podem ser colocados atenuadores de dose, de chumbo, com diferentes
espessuras para 50%, 70% e 90% de atenuao (Silva, 2002) (FIG.3.5).
FIGURA 3.5 - Irradiador de cobalto-60 Gammacell-220. (1) cmara secundria com recipiente para amostras; (2) cmara primria (3) Painel de controle.
S7
O tempo de irradiao, determinado pela taxa de do^e do irradiador, programado no
painel de controle e o trmino da irradiao ocorre automaticamente. As taxas de dose do
irradiador so calculadas mensalmente devido ao decaimento do Co ' .
5.2 Acelerador de Eltrons
No acelerador, os eltrons so produzidos em um ctodo aquecido mantido em uma
regio de potencial mais elevado. Estes eltrons so ento acelerados por uma diferena de
potencial aplicada entre o ctodo e o nodo.
Com a acelerao, os eltrons adquirem energia suficiente para atravessar a janela
de sada, constituda de uma folha fina de titnio (espessuras entre 20 e 40 \im), que
apresenta resistncia mecnica suficiente para suportar a presso atmosfrica do exterior.
Toda a regio de produo e acelerao dos eltrons mantida em alto vcuo para permitir
que a focalizao e a acelerao do feixe em direo janela sejam adequadas. O
acelerador de eltrons deve ser blindados ou estar contido em uma cmara de irradiao
construda em concreto para conter os feixes de raios-X gerados pelo freamento de eltrons
de alta energia.
O produto da intensidade do feixe ou corrente eltrica formada pelos eltrons em
movimento (expressa em mA), pela energia do feixe (expressa em eV), corresponde a
potncia do feixe de eltrons. A potncia mdia do feixe de eltrons est diretamente
relacionada com a taxa de dose de irradiao (SILVA, 2002).
SILVA (2002), descreve os principais componentes do JOB-188 do CTR/IPEN
utilizado nos experimentos. Este acelerador possui energia varivel entre 0,5 e 1,5 MeV,
corrente de at 25 mA e a taxa de dose pode variar de 1,07 kGy/s a 161,67 kGy/s.
O sistema de varredura ("optical and sean system") contm vrias bobinas que so
utilizadas para centralizar e varrer o feixe de eltrons de 60 a 120cm. Essas bobinas
polarizadas determinam a freqncia de varredura. O sistema de vcuo no Dynamitron
JOB 188 utiliza uma bomba mecnica de vcuo e tmia difusora para chegar a um valor de
10" Torr (FIG.3.6). Ficam em vcuo o filamento, parte interna do tubo de acelerao e o
sistema de varredura que fechado pela janela de titnio.
38
FIGURA 3.6 - Acelerador de eltrons Dynamitron JOB-188. (1) sistema de varredura; (2) bomba de vcuo; (3) bandeja com suporte para amostras; (4) esteira transportadora.
39
4 MATERIAIS E MTODOS
4.1 MATERIAIS
4.1.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS
Foram utilizadas amostras de pele humana para aloenxerto de espessura parcial,
(FIG.4.1) retiradas de doador de mltiplos rgos, com dermtomo eltrico, conservadas
em glicerol concentrado (mnimo 85%). As amostras foram cedidas pelo Banco de Tecidos
do histituto Central do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de
So Paulo.
As amostras embaladas receberam sensor indicador de radiao e dosmetro. Para
amostras irradiadas com gama foi utilizado o dosmetro de polimetilmetacrilato Red
Perpex, com range de 5 a 50 kGy. Para amostras irradiadas no acelerador de eltrons foi
utilizado o dosmetro de nitrato de celulose CTA Fuji, com range de 5 a 300 kGy.
No irradiador de ^Co, as amostras foram acondicionadas em recipiente plstico
cilndrico com tampa (14 cm de dimetro e 20 cm de altura) revestido com espuma de
poliuretano
FIGI.TIA 4.1 Exemplo de amostras de tiras de pele de espessura parcial acondicionadas em embalagem selada trmicamente, com identificao de que o material foi irradiado (seta).
40
4.1.2 IRRADIADORES
4.1.2.1 Irradiador de Cobalto-60
As amostras foram irradiadas no irradiador Gammacell-220, do Centro de
Tecnologia das Radiaes do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (CTR-
IPEN/SP). Em outubro de 2003, a atividade da Gammacell-220 era de 5,54 kCi e a taxa de
dose 4,58 kOy/h.
4A.2.2 Acelerador de Eltrons
O acelerador de eltrons modelo JOB-188 do Centro de Tecnologia das Radiaes do
Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (CTR-IPEN/SP), foi ajustado para atingir os
seguintes parmetros de irradiao:
> Energia dos eltrons: 0,73 MeV (clculo em funo da espessura e da densidade da
pele, considerada a mesma do glicerol em que estava imersa, 1,26 g/cm^).
> Corrente: 0,4 mA.
> Freqncia de varredura do feixe de eltrons: lOOHz.
> Velocidade do sistema de transporte (esteira ou bandeja): 3,36 m/min.
> Taxa de dose: 2,44 kGy/s.
> Tempo de exposio da amostra ao feixe de eltrons: 0,5 seg.
Nas condies descritas a dose por uma passagem da amostra sob o feixe de eltrons
foi de 1,0875 kGy.
4.1.3 ENSAIOS BIOMECNICOS DE TRAO
4.1.3.1 Corte do corpo de prova
O corte do corpo de prova foi feito com faca de ao em formato padro de halteres
{'dumbbel') montada em suporte de madeira, com dimenses de acordo com a norma
ASTM D 638: comprimento total de 50 mm e extensmetro (G) com largura de 4 mm e
comprimento de 30 mm. (FIG. 4.2 A e B).Pira realizao dos cortes, as amostras de pele
foram apoiadas em placa de acrlico com a epiderme voltada para cima; sobre ela foi
colocada a faca com a parte cortante voltada para a pele. O corte foi feito com ajuda da
prensa hidrulica Carver modelo C com carga de 1500 kg.
41
FIGURA 4.2 - (A) Faca de ao, em formato de halteres, para corte de corpo de prova, montada em suporte de madeira; (B) dimenses do corpo de prova; (G) extensmetro; (C) corpo de prova de pele.
4,1.3.2 EnsaJos de resistncia trao
Os ensaios de resistencia trao foram realizados na Mquina Universal de
Ensaios Instron, modelo 5567, do CTR/IPEN temperatura ambiente, com mdulo de
carga de 1 kN e garras adequadas para materiais no rgidos.
4.1.4 ESTUDOS MORFOLGICOS
4.1.4.1 Microscpio ptico
As observaes das lminas histolgicas e registros fotogrficos foram realizados
no microscpio ptico Axioplan Cari Zeiss, binocular (ocular lOx e objetiva 40x), dotado
de filtro polarizador e cmara fotogrfica, do Laboratrio de Biologa Molecular do IPEN
(LBM/IPEN).
4.1.4.2 Microscopio eletrnico de transmisso
O estudo ultra-estrutural foi realizado no microscpio eletrnico de transmisso
JEOL JEM-IOOCXII a uma voltagem de 80kV, do Instituto de Cincias Biomdicas da
Universidade de So Paulo (ICB/USP).
CCMSSO HKKmi De EMERilA PiJCLEAR/SP-iPEl
42
4.2 MTODOS
Antes de seu incio, este projeto foi submetido e aprovado pelo Comit de tica em
Pesquisa do Ipen, processo nmero 028/CEP-IPEN/SP (ANEXO A).
Foram disporbilizadas para pesquisa pelo BT-ICHC pele, conservada em glicerol
concentrado (mnimo 85%) de oito doadores (ANEXO B).
4.2.1 PREPARAO DAS AMOSTRAS
De cada doador, foram selecionados conjuntos de amostras de pele por meio da
tcnica de amostragem sistemtica (VIEIRA, 2000) limitando a espessura das amostras
entre 0,15 mm e 0,25 mm. A espessura foi medida com paqumetro com preciso de
0,05 mm (Mitutoyo), antes e aps a irradiao.
As tiras de pele selecionadas como amostras foram cortadas em retngulos de
aproximadamente 6,0 x 5,5 cm e seladas trmicamente em embalagem poli-nylon 5
camadas, com espessura de 0,05 mm e densidade de 1,15 g/cm^. Na face extema da
embalagem foi fixada o identificador de irradiao (FIG.4.1) e o dosmetro adequado para
o tipo de irradiao utilizado.
As amostras levadas para o irradiador de ^Co foram acondicionadas em recipiente
plstico cilindrico tampado. Para evitar o aquecimento das amostras devido ao tempo de
irradiao (5h45min para dose de 25 kGy e l lhSlmin para dose de 50 kGy) foi adicionado
gelo picado dentro do recipiente com as amostras.
Para irradiao com dose de 25 kGy foram selecionados trs conjimtos de amostras
de seis doadores. O primeiro conjimto de amostras foi mantido nas condies iniciais, no
irradiado, denominado gmpo controle. O segundo conjunto de amostras foi submetido
irradiao gama em irradiador de ^Co, Gammacell-220. O terceiro conjunto de amostras
foi exposto ao feixe de eltrons, temperatura ambiente, com sistema de transporte de
esteira no Acelerador Dynamitron JOB 188.
Estudos comparativos, do sistema de transporte no acelerador de eltrons - esteira e
bandeja - na dose de 25kGy temperatura ambiente e em recipiente resfriado com gelo,
foram realizados em amostras de oito doadores.
Para irradiao com dose de 50 kGy foreim selecionados trs conjuntos de amostras
de trs doadores. O primeiro conjunto de amostras foi mantido nas condies iniciais, no
irradiado, denominado grapo controle. O segundo conjunto de amostras foi submetido
43
irradiao gama em irradiador de ^Co, Gammacell-220. O terceiro conjunto de amostras
foi exposto ao feixe de eltrons no Acelerador Dynamitron JOB 188.
Para estudo do efeito de doses crescentes sobre os valores do mdulo de
elasticidade da pele irradiada em comparao pele no irradiada foram selecionadas
amostras de trs doadores para as doses de 15, 25, 30, 40 e SOkGy no irradiador gama e
para as doses de 5, 10, 20, 25, 40 e SOkGy no acelerador de eltrons.
4.2.1.1 Manipulao do material biolgico e instrumentos
Todas as amostras foram manipuladas com equipamento individual de proteo,
isto , luvas de procedimento, mscara cirrgicas e avental, em laboratrio adequado. O
equipamento utilizado (faca de corte, Instron) foram higienizados com lcool ethco 70%
antes e aps sua utilizao. Os instrumentos cirrgicos (pina, bistur, tesoura, frascos)
foram lavados com sabo lquido especial 'Extran', em seguida embalados em envelope
grau cirrgico e autoclavados. O material plstico, que no suporta autoclavagem, foi
embalado adequadamente e esterilizado com radiao ionizante a 25 kGy.
4.2.1.2 Descarte do material biolgico
A pele descartada durante os experimentos foi mergulhada em frasco tampado com
hipoclorito de sdio. O descarte final foi feito em saco plstico apropriado, e o material foi
ento autoclavado. Aps esse procedimento, reahzado no prprio laboratrio, o material
foi embalado em saco branco e depositado em "container" prprio para descarte de
material biolgico de acordo com a NBR-ABTN 12809/1993, que dispe sobre o manuseio
de resduos de servios de sade, e a Portaria Estadual CVS 01, de 18 de janeiro de 2000,
que estabelece que a unidade (laboratrio de pesquisa) deve instituir aes para garantir o
princpio da biossegurana nos programas de garantia da qualidade.
4.2.2 ENSAIOS BIOMECNICOS DE RESISTNCIA TRAO
Aps a irradiao e antes dos ensaios biomecnicos, as amostras foram lavadas em
soluo salina 0,9% estril e mergulhadas em nova soluo por 15 minutos para retirada do
glicerol, reidratao e recuperao das caractersticas fsicas normais do tecido como a
maleabilidade e opacidade (HERSON, 1999), simulando as condies rotineiras de uso no
cenfro cirrgico.
44
Os ensaios de resistncia trao foram realizados segundo a norma ASTM D638
(1977) na Mquina Universal de Ensaios Instron com o mdulo de carga de 1 kN (FIG.
3.4). Nos ensaios, o corpo de prova (FIG. 4.2 C) foi fixado a uma distncia de 27 mm entre
garras e submetido trao at a ruptura da amostra. A velocidade de afastamento das
garras foi de 30 mm/min. Os ensaios foram realizados temperatura ambiente de
aproximadamente 23 C e umidade relativa do ar de 50 %.
Os grficos, obtidos com o programa Merlin 2.21 da Mquina de Ensaios Instron,
apresentaram a curva da relao entre a tenso de trao aplicada e o correspondente
alongamento da amostra.
A resistncia trao na ruptura representada pela tenso ou "stress" (a, em MPa)
que a razo entre a fora aplicada (F, em N) e a rea da seo transversal (A, em mm):
a = F/A (1)
A deformao ou "strain" (s, em mm/mm) da amostra o resultado da variao do
comprimento (L) pelo comprimento inicial (Li):
s = L / L i ; sendo que L = L 2 - L 1 (2)
onde, L2= comprimento final.
O mdulo de elasticidade (E) foi calculado na poro linear da curva, como
ilustrado na FIG.4.3, dividindo-se a variao de tenso ("stress") correspondente a urna
seco do segmento, pela correspondente variao de alongamento ("strain"):
E = Aa/As ou E = oi-ai /s2- i (3)
O mdulo de elasticidade (E) ou mdulo de Young a relao entre a tenso e o
alongamento do tecido, na regio elstica da curva. Assim, quanto mais resistente o tecido
ao alongamento, maior o valor do mdulo de elasticidade.
A FIG.4.3 ilustra o procedimento de clculo do mdulo de elasticidade no grfico
obtido pelo software Merlin 2.21, programa da Mquina Universal de Ensaios Instron
compatvel com Windows 3.1.
45
FIGURA 4.3 - Grfico obtido com o software Merlin 2.21, mosfi-ando o prolongamento da poro linear ( / ) e a indicao dos valores de tenso (CTI e 0 2) e de alongamento (E 1 e E 2) para clculo do mdulo de elasticidade de acordo com a equao E = Aa/Ae (3).
4.3 HISTOLOGIA
Foram preparadas amostras de pele ( 3 x 1 0 mm) do grupo controle e dos grupos
experimentais para montagem de lminas histolgicas. As tcnicas de colorao utilizadas
foram a colorao de rotina com hematoxilina-eosina, tricromo de Mallory e picro-sirius
(sendo as duas ltimas coloraes especficas para colgeno), e resorcina de Weigert
(colorao especfica para fibras do sistema elstico).
As amostras, inicialmente fixadas em formaldedo 10%, foram desidratadas em
banhos com solues crescentes de etanol (de 70% at o lcool absoluto) e diafanizadas
com xilol. Em seguida, foram imersas em parafma e mantidas em estufa. Procedeu-se,
ento, a incluso em parafina e montagem em bloco de parafma. Os cortes histolgicos
foram realizados no micrtomo, com os blocos de parafinas endurecidos e esfriados com
gelo, na espessura final de 5 |am. Os cortes foram colocados em banho-maria (40 C) e em
seguida distendidos em lminas de vidro apropriadas para microscopia de luz. As lminas
secaram em estufa a 56 C.
Previamente colorao foi promovida a desparafinizao do tecido com xilol e
sua hidratao com banhos subseqentes de lcool etlico absoluto at a soluo diluda de
70%. A colorao se processou mergulhando-se as lminas em cubetas com os corantes e
seqncia especficos de acordo com o protocolo de determinada tcnica de colorao. Os
procedimentos descritos foram realizados no Laboratrio de Histologia do Departamento
de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Os protocolos para
os tipos de colorao utilizados so encontrados em Behmer (1976).
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As observaes das lminas e registro fotogrfico foram realizados no LBM/IPEN
em microscopio Axioplan Cari Zeiss (ocular lOx e objetiva 40x) dotado de cassete
fotogrfico. Para as observaes e registro fotogrfico das lminas coradas com picro-
sirius utilizou-se o filtro polarizador e analisador.
4.4 U L T R A - E S T R U T U R A
Foram preparadas amostras de pele do grupo controle e dos grupos experimentais,
fixadas em Kamovsky 2% (glutaraldedo 2%: paraformoldedo 2%: tampo cacodilato de
sdio 0 , lMpH 7,3).
Os procedimentos descritos a seguir (Bozzola, 1992) foram realizados no
Laboratorio de Biologa do Endomtrio do Departamento de Histologa e Embriologa do
Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo.
Aps a fixao, os fragmentos de 1 x 1 mm foram lavados em tampo cacodilato de
sdio 0,1 M com pH 7,3 e ps-fixados em tetrxido de osmio a 1% em tampo fosfato
0,1M temperatura ambiente. Em seguida, os fragmentos foram desidratados em uma srie
crescente de concentraes de etanol e infiltrados com resina Sprr e xido de propileno
na proporo de 1:1. Para incluso os tecidos foram deixados em resina pura temperatura
ambiente. Em seguida os fragmentos foram orientados em forma apropriada para obteno
de corte transversal no qual possam ser obsei-vadas epidemie e demie. Os fragmentos
permaneceram em estufa seca a 60 C para polimerizao da resina e formao dos blocos.
Os blocos foram cortados em micrtomo com navalha de vidro em cortes semi-
finos de 1 |im, que foram corados com azul de toluidina a 0,25% em borato de sdio a 1%
em gua destilada. A partir da observao dos cortes semi-finos ao microscpio de luz,
foram definidos os melhores campos para a realizao dos cortes ultrafinos. Os cortes
ulfrafmos com cerca de 60 nm de espessura, foram identificados por sua cor prateada
devido ao ndice de refrao quando flutuam na gua da cuba do micrtomo.
Os cortes selecionados foram depositados em tela de cobre sobre a qual foi
realizada a contrastao com soluo de acetato de uranila 2%, seguida de contrastao
com cfralo de chumbo.
As observaes e registro fotogrfico foram realizadas no microscpio eletrnico
de fransmisso JEOL JEM-IOOCXII a uma voltagem de 80kV (ICB/USP).
COWSSO tmomi iwnm fu:mjs.F-^^j--
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4.5 ANALISE ESTATSTICA
Os valores do mdulo de elasticidade para as amostras de pele apresentaram grande
disperso, por isso se fez necessrio aplicar testes estatsticos para verificar a significncia
dos resultados.
4.5.1 Anlise estatstica descritiva
Inicialmente, foi realizada a anlise exploratria dos dados e a eliminao de
valores ''outliers " que pudessem comprometer o estudo.
Definiu-se como unidade amostrai, o conjunto de dados de um doador. As medidas
estatsticas de tendncia central e medidas de variabilidade foram calculadas para os
valores do mdulo de elasticidade dos grupos controle e de cada um dos grupos
experimentais.
4.5.2 Teste de signifcncia
Foi proposto o teste de significncia t de Student, entre os grupos da mesma
unidade