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30/11/2018
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 1josé fernandes
J. Oliveira Fernandes
Lab. de Bromatologia e Hidrologia
Faculdade de Farmácia U. Porto
HPLCHigh Performance Liquid Chromatography
Cromatografia líquida de alta eficiência
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 2josé fernandes
É uma técnica cromatográfica em coluna
A fase móvel é sempre um líquido
As amostras são analisadas em solução
O processo de separação pode ser de:
partilha, adsorção, troca iónica, exclusão
HPLC
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 3josé fernandes
• Colunas reutilizáveis de pequeno diâmetro interno (≤ 2-5 mm)
• Fases estacionárias constituídas por partículas muito pequenas (3-50 µm)
• Pressões relativamente elevadas à entrada da coluna e fluxo controlado da fase móvel
• Introdução precisa da amostra, sem a necessidade de se dispor de grandes quantidades
• Detectores contínuos capazes de lidar com pequenos fluxos da fase móvel e de detectar quantidades muito pequenas de substâncias
• Análises rápidas e com boa resolução (poder de separação)
A técnica de HPLC caracteriza-se por:
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 4josé fernandes
Representação esquemática de um sistema de HPLC
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 5josé fernandes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 6josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 7josé fernandes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 8josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 9josé fernandes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 10josé fernandes
a- recipiente
b- tubo de aspiração
c-filtro
Reservatório da fase móvel - Eluente(s)
� Nº de reservatórios (sistemas binários, ternários, etc.)
� Grau de pureza dos solventes• reagentes HPLC-grade• água desionizada
� Filtração dos solventes• solventes orgânicos – PTFE/teflon®
• água - celulose
� Técnicas de desgasificação• borbulhamento de hélio• aplicação de vácuo• ultra-sons• aquecimento
Factores a considerar
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 11josé fernandes
Bombas
• Têm como função transferir para a coluna, sob pressão, uma determinada quantidade de solvente/eluente por unidade de tempo
• Devem gerar um fluxo constante e reprodutível: 0.01 to 5 ml/min (cromatografia preparativa > 10 mL/min)
• Têm de ser resistentes aos líquidos que compõem o eluente e a valores extremos de pH
• Devem funcionar entre gamas de pressão de 1 a 5000 psi
• A maior dificuldade consiste na imperiosa necessidade de evitar a introdução de bolhas de ar no seio do eluente
• Eluição isocrática – Uma só bomba é suficiente
• Eluição por gradiente – São necessárias tantas bombas quanto o número de eluentes a usar
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 12josé fernandes
Bombas
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 13josé fernandes
O sistema de injecção consiste numa válvula de
injecção com um anel de amostragem (sample
loop) de volume fixo, onde a amostra é
previamente colocada por intermédio de uma
micro-seringa.
A rotação da válvula desvia a corrente de eluente
(proveniente da bomba) para o anel,
encaminhando desta forma a amostra para o
início da coluna
Injector ou Camâra de Injecção
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 14josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 15josé fernandes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 16josé fernandes
AUTOINJECTORES ou ANALISADORES AUTOMÁTICOS
Permitem o automatismo do processo
Contribuem para a repetibilidade e reprodutibilidade (>precisão)
Diminuem a possibilidade de contaminação
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 17josé fernandes
COLUNA:ONDE TODO O PROCESSO DE
SEPARAÇÃO OCORRE
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 18josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 19josé fernandes
COLUNASMaterial: aço inoxidável, vidro (ou plástico)
Diâmetro interno: 2-5 mm Trata-se de uma variável muito importante: para o mesmo comprimento, uma coluna com maior diâmetro interno possui uma maior capacidade de carga, permite maiores fluxos de eluente, mas conduz a uma maior diluição das bandas dos solutos
Diâmetro das partículas de enchimento da coluna: 10 µm, 5 µm ou inferiorOs enchimentos com partículas menores apresentam uma área superficial mais elevada e desta forma uma maior capacidade de resolução dos solutos
Diâmetro externo: em regra, 6,35 mm, independente do diâmetro interno. As colunas preparativas apresentam maior diâmetro
Comprimento: 10-30 cmO comprimento da coluna afecta a eficiência e a rapidez da separação: colunas mais longas possuem maior eficiência mas conduzem a um tempo de análise maior; colunas mais curtas permitem separações mais rápidas mas apresentam menor eficiência
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 20josé fernandes
Column Length and Mechanical Separating Power [Same Particle Size]
Particle Size and Mechanical Separating Power [Same Column Length]
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 21josé fernandes
FILTROS PRÉ-COLUNA e GUARD COLUMNS
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 22josé fernandes
FILTROS PRÉ-COLUNA e GUARD COLUMNS
COLUNA
Para reduzir a possibilidade de obstrução da coluna deve eliminar-se a presença de pequenas partículas:
Manter os reservatórios de solventes sempre limpos e fechados
Filtrar todas as amostras antes da injecção com filtros < 2 µm de porosidade
Substituir periodicamente todos os vedantes
Usar pré-filtros colocados entre o injector e a coluna (capazes de filtrar pequenas partículas provenientes da amostra e dos
materiais vedantes sem contribuir significativamente para a dispersão da amostra antes desta chegar à coluna). Estes
filtros não devem contribuir para aumentar significativamente o volume morto e, dessa forma, afectar negativamente a
performance cromatográfica
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 23josé fernandes
FILTROS PRÉ-COLUNAS e GUARD COLUMNS
A “guard column” deve conter o mesmo material que a coluna analítica (mesma fase estacionária)
pois a sua função é a de proteger a coluna de componentes da amostra que reajam negativamente
com a fase estacionária
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 24josé fernandes
Detector
• O detector analisa continuamente a fase móvel
• À medida que cada componente da mistura sai da coluna e atinge o detector, produz-se um sinal que é transmitido e registado
• A sequência de sinais obtidos durante a análise origina o cromatograma
Tem a função de converter em sinal eléctrico a concentração de cada componente eluído da coluna
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 25josé fernandes
Detectores mais comuns em HPLC
• Detector de Índice de Refracção
• Detector de Ultra-Violeta (UV-VIS)λ fixo (normalmente 254 nm)λ variávelDetector de díodos ou “diode array”
• Detector de Fluorescência
• Detectores Electroquímicos
• MS, NMR, NIR, LSD
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 26josé fernandes
A ELUIÇÃO em cromatografia em coluna
Uma típica separação cromatográfica em coluna:
-A amostra (mistura de A e B) é colocada no topo da coluna (um tubo estreito cheio com um sólido inerte - sob a forma de partículas muito pequenas
- que suporta a fase estacionária na sua superfície).
-A introdução de sucessivas porções de eluente“fresco” (fase móvel) vai provocar o deslocamento
dos componentes da amostra (eluição).
-O componente B tem maior afinidade para a fase estacionária do que o componente A, pelo que se “atrasa”, saindo da coluna (parte inferior) depois
dele.
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 27josé fernandes
CROMATOGRAMA
É um gráfico dado por um registador que
regista o sinal detectado em função do
tempo. É essencial à analise qualitativa e
quantitativa: a posição dos picos no eixo
do tempo (tempo de retenção) é usada
para identificar os componentes da
amostra; a área de cada pico é função da
quantidade do componente respectivo na
amostra
A ELUIÇÃO em cromatografia em coluna
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 28josé fernandes
HPLC vs TLC
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 29josé fernandes
TIPOS DE INTERACÇÃO ELUENTE-SOLUTONA COLUNA
ADSORÇÃO
PARTILHA
TROCA IÓNICA
TAMIZAÇÃO MOLECULAR
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 30josé fernandes
Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um material de suporte impregnado com um líquido
Cromatografia de Partilha
Os componentes da mistura a
separar (amostra), dissolvidos na
fase móvel, distribuem-se entre esta
e a fase estacionária (líquido a
revestir um suporte sólido) em
função da solubilidade em cada uma
dessas fases, até se atingir um
equilíbrio. Assim, a separação faz-
se com base na diferença nos
coeficientes de distribuição ou de
partição (K) entre as duas fases.
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 31josé fernandes
SEMELHANTE À EXTRACÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO
OS COMPONENTES MAIS RETIDOS SÃO MAIS SOLÚVEIS NA FASE ESTACIONÁRIA DO QUE NA FASE MÓVEL
A SEPARAÇÃO OCORRE BASEADA NA DIFERENÇA DESOLUBILIDADE DOS VÁRIOS COMPONENTES DAAMOSTRA NA FASE ESTACIONÁRIA
PARA ALÉM DA SOLUBILIDADE (partilha) HÁ OUTROSFACTORES QUE CONDICIONAM A SEPARAÇÃO
Cromatografia de Partilha
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 32josé fernandes
Cromatografia de Partilha
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 33josé fernandes
Cromatografia de Partilha
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 34josé fernandes
Reacção de um grupo silanol superficial com um silano monofuncional
Reacção de grupos silanos superficiais com um silano bifuncional
Cromatografia de Partilha
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 35josé fernandes
Cromatografia de Partilha
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 36josé fernandes
Cromatografia de Partilha
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 37josé fernandes
Existem dois tipos de processos distintos:
“Normal Phase”: a fase estacionária é polar e a fase móvel é apolar
“Reversed Phase”: a fase estacionária é apolar e a fase móvel é polar
O trabalho em fase normal foi o primeiro a ser utilizado, mas hoje o trabalho em fase reversa (RP) é mais comum
Cromatografia de Partilha
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 38josé fernandes
Si – O – CH2 (CH2)x-CH2-Grupo Polar
Si – O – CH2 (CH2)16-CH3
HEXANO
MeOH/H20
NORMAL PHASE
REVERSED PHASE
Cromatografia de Partilha
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 39josé fernandes
REVERSED PHASE NORMAL PHASE
Fase reversa vs Fase normal
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 40josé fernandes
Fase reversa vs Fase normal
Restek® ULTRA C-18 and CN Columns (250mm x 4.6mm, 5µ), Mobile Phase: (1:1 Methanol:Water), 1.5 mL/min.
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 41josé fernandes
Normalmente não é possível trabalhar apenas com um solvente (líquido puro)
É necessário usar como eluente uma mistura de líquidos (2 ou +)
Cromatografia de Partilha - Eluentes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 42josé fernandes
Cromatografia de Partilha - Eluentes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 43josé fernandes
• Miscibilidade
• Inércia química
• Absorção no UV
• Viscosidade
• Toxicidade
• Inflamibilidade e volatilidade
• Força do solvente – medida da polaridade relativa do solvente
Factores que determinam a escolha dos solventes
Cromatografia de Partilha - Eluentes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 44josé fernandes
Cromatografia de Partilha - Eluentes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 45josé fernandes
MetanolAcetonitrilo
TetrahidrofuranoÁgua
Pouco viscososObtêm-se puros
MiscíveisTransparentes ao UV
Cromatografia de Partilha - Eluentes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 46josé fernandes
Cromatografia de Partilha - Eluentes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 47josé fernandes
HPLC em Fase reversa (C18)
Usa-se geralmente uma mistura de 2 solventes
Água+
Metanol ou Acetonitrilo
O solvente orgânico (menos polar) apresenta maior força de eluição, pelo que quanto maior for a sua % na mistura mais rapidamente os picos são
eluídos, ou seja, menores são os tempos de retenção
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 48josé fernandes
Metanol/água (90:10) Metanol/água (55:45)
HPLC em Fase reversa (C18)
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 49josé fernandes
HPLC em Fase reversa (C18)
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 50josé fernandes
A COMPOSIÇÃO DO ELUENTE É ALTERADADURANTE A ANÁLISE
HPLC – Eluição em Gradiente
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 51josé fernandes
O problema geral da eluição
• Considerar a Figura ao lado: mistura de seis componentes, constituindo 3 pares com características semelhantes (coeficientes de distribuição � tempos de retenção)
• Em a) as condições estão bem ajustadas para a separação dos componentes 1 e 2, mas não para os restantes (tempo a mais, com alargamento dos picos).
• Ajustando as condições de eluição para os componentes 5 e 6, deixa de haver separação entre os componentes 1 e 2 e entre os componentes 2 e 3. É este o chamado problema geral da eluição.
• Como sair desta situação?
– LC: Alterando a composição do eluente ao longo do tempo (durante a separação…)
– GC: alterando a temperatura
Eluição em gradiente ou Programação do eluente
Programação da temperatura
Nota: este tipo de eluição opõe-se à chamada eluição isocrática, i.e., em que as condições se mantêm constantes durante toda a separação
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 52josé fernandes
Intervalo
(min)
Metanol (%) Água (%)
0-12 60 40
12-20 60 – 90 40 – 10
20-25 90 10
Em fase reversa, o gradiente consiste em aumentar, de forma gradual ou
por patamares, a quantidade relativa de solvente orgânico (metanol ou
aceonitrilo) à medida que o processo avança
HPLC – Eluição em Gradiente
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 53josé fernandes
Overlay of the four components trace analysis chromatograms. (A) is the
isocratic elution, (B) is the gradient elution, shadow line is the gradient
profile from 30% acetonitrile in water to 65% acetonitrile
HPLC – Eluição em Gradiente
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 54josé fernandes
HPLC – Importância do pH• O pH é de grande importância para a separação e para a detecção de compostos com
características acídicas e básicas
• As colunas normalmente usadas são muito sensíveis a meios básicos ou muito ácidos
• pH > 8 dissolução do gel de sílica
• pH < 2 hidrólise da ligação da sílica aos grupos C 18
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 55josé fernandes
HPLC – Importância da temperatura
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 56josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 57josé fernandes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 58josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 59josé fernandes
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 60josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 61josé fernandes
HPLC – Exemplo de Cromatogramas
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 62josé fernandes
HPLC – Exemplo de Cromatogramas
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 63josé fernandes
HPLC – Exemplo de Cromatogramas
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 64josé fernandes
Figure 2: HPLC chromatogram of reference standards, rutin, quercitrin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin with corresponding
retention times at λ = 350nm. Separation of the flavonols was achieved at 45°C on a minibore Phenomenex Luna 5µm C18 (2) column
with dimensions 250 x 2.00mm using a one step linear gradient and flow rate of 400µl/min. Mobile phase A (acetonitrile) and B (0.3%
formic acid) ratios where changed after 15 minutes from 15:85 to 25:75 and total run time was 33 minutes.
HPLC – Exemplo de Cromatogramas
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 65josé fernandes
HPLC – Exemplo de Cromatogramas
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 66josé fernandes
Chromatographic conditions: Analytical column: Hypersil GOLD C18 3µm 150x4.6mm
Guard column: Hypersil GOLD C18 3µm
Col. temperature: 40 °C Inj. volume: 10µL Flow: 2.0mL/min
Mobile phase: A: 40mM NaH2PO4/Na2HPO4 (1:1) buffer pH=7.8 B: AcN/MeOH/H2O (45/45/10 v/v/v)
Detection: UV absorbance @ λ=338nm
HPLC – Exemplo de Cromatogramas
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 67josé fernandes
HPLC – Detector “Diode-array”
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 68josé fernandes
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 69josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Métodos baseados na construção de uma Curva de Calibração
Método do padrão externo (o mais usual em HPLC)
Método do padrão interno (o mais usual em GC)
Método das Adições de Padrão
Normalização
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 70josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Métodos baseados na construção de uma Curva de Calibração
Seja a quantificação feita pelo método do padrão externo ou pelo método do padrão interno, as curvas de calibração podem ser construídas a partir de:
1. Análise directa de soluções padrão com concentrações crescentes (feitas em solvente
adequado)
2. Análise de soluções padrão com concentrações crescentes (feitas em solvente adequado)
depois de sujeitas à totalidade do processo de extracção/clean-up a que é sujeita a
amostra
3. Análise de soluções padrão com concentrações crescentes (feitas em matrizes sintéticas
que constituam uma “imitação” das amostras), depois de sujeitas à totalidade do
processo de extracção/clean-up a que é sujeita a amostra
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 71josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Método do Padrão Externo
Implica a construção de uma Curva de Calibração clássica:
Área do pico em função da concentração da espécie que se pretende quantificar
Concentração
Área do pico
� É o método mais usado em HPLC
� Apresenta como ponto mais frágil o facto de não haver hipótese de detectar e de compensar devidamente qualquer anomalia que surja durante todo o processo analítico a que as amostras são sujeitas: p. ex., engano na medição de um volume durante o processo extractivo; perda do analito numa coluna de SPE mal solvatada; injecção de uma quantidade indevida, etc.
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 72josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
� Implica a adição a todas as soluções de calibração (soluções padrão) e a todas as amostras de uma quantidade igual de uma segunda substância designada por padrão interno
� O padrão interno deve apresentar as seguintes características:
� Ter um comportamento químico e físico o mais idêntico possível ao do analito
� Não estar presente nas amostras
� Dar origem nas amostras a picos cromatográficos bem resolvidos
Método do Padrão Interno
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 73josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Método do Padrão Interno
Implica a construção de uma Curva de Calibração alternativa:
Relação área do pico de analito/ área do pico do padrão interno em função da concentração da espécie que se pretende quantificar
Concentração
Área do pico/Área do PI
� É o método mais usado em GC
� Permite compensar automaticamente qualquer anomalia que surja durante todo o processo analítico a que as amostras são sujeitas. Qualquer perda (ou ganho) anormal de analito durante todo o processo, irá afectar de igual forma a área do pico correspondente ao padrão interno
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 74josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Método das Adições de padrão
Fundamenta-se no traçado de uma curva de regressão de A em função da concentração ou da massa de analito adicionado a alíquotas da amostra contendo a espécie que se pretende quantificar.
Área do pico ouÁrea do pico/Área do PI
Quantidade adicionada
A = Área do pico do analito
i) Método do Padrão Externo
A = Área do pico do analito/área do pico do PI
ii) Método do Padrão Interno
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Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 75josé fernandes
O resultado é calculado com base no valor da abcissa
correspondente à interpolação do dobro da ordenada
na origem ou pelo módulo da abcissa obtido após
extrapolação da recta de regressão.
A
m
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Método das Adições de padrão
Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 76josé fernandes
Métodos Cromatográficos – Quantificação
Método da Normalização
Consiste em considerar o somatório das áreas de todos os picos cromatográficos como
100% e quantificar o analito em estudo pela % relativa da área do respectivo pico
Tem uma aplicação muito reduzida, sendo útil apenas em casos muito especiais (p. ex.
quantificação de ácidos gordos por GC em amostras de gorduras alimentares)