Boas práticas de laboratório e

biossegurança na manipulação

de vírus

Prof. Dr. José Luiz Proença Módena

13/10/2016

Universidade de Campinas

Instituto de Biologia

Departamento de Genética, Evolução e

Bioagentes

Definindo um vDefinindo um víírusrus

Replique-me

Vírus são extremamente pequenos

O Virion e o vírus

Os vírus são organismos com duas fases

Estrutura viral

Vírus nús

Vírus Envelopados

Lipid

Glycoprotein

Matrix

Critérios Avaliação de risco para vírus

• Virulência

• Modo de transmissão• Estabilidade• Estrutura da partícula viral

• Concentração e volume

• Origem do vírus

• Disponibilidade de medidas profiláticas

• Dose infectante

• Tipo de ensaio

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Manual de Biossegurança Anvisa, 2010

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe I

•Cepa virais atenuadas•Vírus naturalmente não patogênicos

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe II

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe II

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe II

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe II

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe II

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe II

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe III

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe III

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe IV

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe IV

Classe de risco dos vírus

Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.

Classe IV

Classe de riscos dos agentes impacta diretamente nas

recomendações de biossegurança

• Pelo que foi falado até aqui, éapenas o nível de risco biológico que determina as recomendações de biossegurança para um determinado procedimento?

Trabalhando com vírus em laboratório NB2

Equipamentos de proteção individual (EPI)•Avental•Luvas•Mascaras•Óculos de proteção•Sapatos fechados (propé)

Equipamentos de proteção Coletiva (EPC)•Cabine de segurança biológica Classe II A•Lava olhos•Autoclave

Trabalhando com vírus em laboratório NB2

Boas práticas em laboratórios clínicos (BPLCs)•Proibido comer•Prender cabelo•Uso IPIs•Limpar superfícies antes e após o uso•Nunca pipetar com a boca•Nunca reencapar agulhas•Descartar resíduos adequadamente, autoclavar material antes do descarte•Lavar as mãos sempre que deixe o laboratório

Trabalhando com vírus em laboratório NB2

Trabalhando na cabine Classe II

• Limpar a superfície da cabine com álcool 70%• Ligar Luz ultra violeta por 15 minutos• Restringir fluxo de pessoas durante uso da cabine• Limpar os objetos antes de introduzi-los na Cabine (álcool 70%)• Colocar o material na área de trabalho, de modo a formar

diferentes ambientes (limpos e sujos) dentro da cabine• Nunca usar bicos de Bunsen dentro da cabine• Sempre tenha um descarte com hipoclorito 1% dentro da cabine• No término, limpar os objetos com álcool 70% antes de retirá-los

da cabine• Limpar a superfície com hipoclorito 1% e depois álcool 70%.• Ligar a luz UV por 15 minutos

Trabalhando com vírus em laboratório NB2

Trabalhando com vírus em laboratório NB3

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

•Vírus de DNA;

• Fita Simples;

• Não Segmentado;

• Capsídeo icosahédrico com 18 a 26nm;

• Não envelopado;

Brieu et al, 2007Gurda et al, 2010

Bocavírus Humano

Hantavirus Araraquara

Família Bunyaviridae•Vírus de RNA de polaridade negativa tri-segmentado•Transmitido pela excretas de roedores (via inalatória)•Síndrome pulmonar por hantavírus (alta letalidade, próxima dos 30% em humanos)

Washington University in Saint Louis (EUA)

VVíírus Oropoucherus Oropouche

ribonucleocapsid

Lipid envelope

Gn and Gc

RNA polymerase

� Arbovírus circulante na América Central e caribe

� Pertence a família Bunyaviridae, genus Orthobunyavirus

� Genoma segmentado de RNA de polaridade negativa

� S: N and NSs

� M: Gc, Gn and NSm

� L: RNA polimerase

Oropouche : ciclos de transmissãoOropouche : ciclos de transmissãoCiclo na mata

Hospedeiros vertebrados: preguiças, macacos,

passáros.

Vetores: Aedes serratus and Coquillettidia

venezuelensis.

Ciclo Urbano

Hospedeiros vertebrados: homem, animais

domesticos?

Vectors: Culicoidis paraensis or Culex

quinquefasciatus.

OROV causou mais de 30 epidemias na região amazônica, com mais de 500.000 casos reportados

Oropouche: doenOropouche: doençça em humanosa em humanos

� Febre do Oropouche

◦ Sintomas: febre (39oC), mialgia, dor de cabeça, artralgia, fotofobia e mal estar. Alguns pacientes tem sinais hemorrágicos, como exantema, petequias e sangramento de gengivas.

� OROV é associados com sinais de acometimento neurológico, encafalite e meningite

� Pode estar associado com abortos

Sala de Paramentação Sala de Apoio

Na sala da esquerda (WNV, CHIKV)

Trabalhávamos com:

• jaleco descartável de plástico (não era de corpo inteiro)•Propé de plástico•Máscaras N95•Óculos de proteção•Luva pele até o cotovelo•Segunda luva•Touca descartável

Na sala da direita (OROV, VEEV)

•Trabalhávamos com:•Macacão impermeável de corpo inteiro•Propé de plástico•Respirador PFF2•Luva pele até o cotovelo

Trabalhando com vírus em laboratório NB3:

Procedimentos de Segurança

Entrando e trabalhando no NB3

•Vestir todo o aparato de segurança

•Checar a pressão da sala antes de entrar

•Sempre trabalhar em dupla

•Nunca permanecer no local por mais de 6 horas

•Procedimentos que envolvam chance de aerossol (vortex, centrifugação, Magnalyser) devem ser conduzidos dentro da cabine de segurança)

•Cabines de segurança II-B

•Usar sempre dois pares de luvas e descartar o primeiro par antes de remover a mão da cabine (deixar um saquinho autoclavável para isso na cabine)

Trabalhando com vírus em laboratório NB3:

Procedimentos de Segurança

Acidentes:

• Em caso de derramamento de liquido, parar o que estiver fazendo, cobrir com um papel toalha embebido em hipoclorito e sair do ambiente. Deixar agindo por pelo menos 30 minutos

• Em caso de acidentes com agulha ou mordida de animais: ser encaminhado para quarentena em ambiente isolado

• Os freezers devem ser monitorados por uma central que avisa o pesquisador responsável assim que tiver alterações significantes de temperatura

Trabalhando com vírus em laboratório NB3:

Procedimentos de Segurança

Saindo do NB3:

•Ir até a área limpa próxima a porta de saída e remover o propé para pisar na área demarcada

•Borrifar Lisol no corpo, braços e mascárá

•Repetir o processo com Hipoclorito, depois álcool 70% e por fim água

•Sair da sala de experimentação até a ente sala

•Remover o capacete, o macacão e a luva pele, evitando encostar a parte externa da roupa na pele

•Descartar em lixo que deve ser autoclavável

•Usar testes de esterilidade de autoclave em todas as corridas (o lixo deve ser incinerado após autoclavação)

•Lavar bem as mãos

Trabalhando com vírus em laboratório NB3:

Procedimentos de Segurança

Manipulando animais:

• Sempre abrir as gaiolas em cabines de segurança, mesmo que seja para limpar a gaiola

• Sempre que trabalhar com animais anestesiados (quetamina e xelazina)

• Nunca trabalhar com grupos muito grande de animais num mesmo dia

• Evitar trabalhar de noite, pois os camundongos são mais ativos nesse período

Linhas de pesquisaLinhas de pesquisa� Caracterizar o papel de outros PPR no controle de OROV e outros

arbovírus?

� Como IRF-5 controla a neuroinvasão pelos bunyavírus e flavivírus (Zika)?◦ Infecção em animais KO para Rag e uMT, replicação em células endoteliais, Mecanismos

de cavalo de Troia, transporte retrógrado.,

� Quais componentes virais são importantes no antagonismo de IFN-I?

Em colaboração:

� Caracterizar epítipos lineares de Zika� Caracterizar as citocinas no soro dos pacientes com Zika� Desenvolver novos métodos de diagnóstico� Caracterizar o papel de imunomoduladores para aumentar a eficiência

vacinal para Zika� Desenvolver vacinas alternativas contra Zika e OROV� Caracterizar possíveis antivirais contra Zika

� Polimorfismo gênico/microbioma e doença grave por Zika

ObrigadoObrigado

Diamond Lab

Collona Lab•Renata Sesti Costa

Eurico Arruda (FMRP-USP-Brazil)

Andrew Pekosz (Johns Hopkins University – USA)

Michael Gale, Jr (University of Washington – USA)

Funding: SBV: