Post on 06-Apr-2016
BIOCHEMIE
Elektrophorese, Immunodetektion
Regulation der bestehenden Enzymmenge
• Post-translational durch reversible, kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Reduktion)• pH-Wert, (Co-)Substratkonzentration• Effektoren• Enzym-Inhibitorprotein-Interaktionen (14-3-3 Proteine)
Regulation von Enzymaktivitäten - Ebene 1 -
Enzyme können auf folgenden Ebenen reguliert werden
Enzymreinigung Chromatographie
Regulation von Enzymaktivitäten- Ebene 2 -
Regulation der Enzymproteinmenge Genexpression
• Transkription (Induktion/Repression)• Splicing, mRNA Stabilität• Translation• Proteolytischer Abbau
Enzymproteingehaltsbestimmung Elektrophorese, Blotting
ElektrophoresePrinzip
„Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld“
Proteine, DNA, RNA, organische Säuren, Kationen etc.
Aminosäuren sind amphotere/zwitterionische Verbindungen
Elektrophoretische Trennung von Proteinen
Proteine weisen positive und negative Ladungen auf ihrer Oberfläche auf.
Matrices bzw. GelePolyacrylamidgele
Stabilisierungder wanderndenProteinbandenin Gelen
Die Monomerkonzentrationen bestimmen die Porengrössender Polyacrylamidgele
Matrices bzw. GelePolyacrylamidgele
T [%] = (a + b) * 100 / VC [%] = b * 100 / (a + b)
a....Gewicht an Acrylamidb....Gewicht an MethylenbisacrylamidV....Volumen in mL
Zusammenhang zwischen Porengrösse und %T sowie %C
Fall AC konstant T erhöht
Porenweite sinktFall BT konstant C erhöht
PeakverteilungMinimum bei 4% C,
bei höheren und niedrigeren Konzentrationen nehmen die Porengrössen wieder zu
Geometrie der Gelelektrophorese
Rundgele vs.Flachgele
horizontal vs.vertikaleSysteme
Elektrophorese-Apparaturen
Elektrophoretische TrennprinzipienPolyacrylamid-Gelelektrophorese
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Isoelektrische FokussierungBildung des pH-Gradienten
Trägerampholyte sind Oligoamino-oligocarboxylsäuren
Sie weisen ver-schiedene Isoelek-trische Punkte auf
Elektrophoretische Mobilität vTrennung von Proteinen erfolgt aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität
++
+
+-
--
- ---
+
+++
++--
--
+ -
Ano
de
Kat
hode
v = E . z / (6 r) E...elektr. Feld...Viskosität
• Nettooberflächenladung z pH-abhängig
• Molekülgrösse, -form r Stoke`scher Radius
diskontinuierliche PAGEKombination aus Isotachophorese
und Zonenelektrophorese
native PAGE
• keine Proteindenaturierung
• Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse d.h. Proteine verschiedener Molekülgrösse können in der nativen PAGE gleich schnell wandern
• kann auch zur Reinigung nativer Proteine eingesetzt werden
• optimierbar über Pufferzusam- mensetzung, pH-Wert und Porengrössen
SDS-PAGESodium dodecylsulphate
SDS ist ein anionisches Detergens, das in stöchiometrischem Verhältnis von 1.4 g SDS je an 1 g Protein bindet
Hierbei wird die native Konfiguration in eine ellipsoide K. aufgefaltet
SDS-PAGEVorteile
• die Oberflächenladungen der Proteine werden maskiert
• die Menge der „neuen“ negativen Ladungen korrelieren mit der Masse des Proteins (in Dalton)
• alle Proteine besitzen nach der Auffaltung diesselbe Konfiguration
• die Trennung erfolgt folglich nach Molekularmasse der Proteine
• Ausnahmen: Glykoproteine, Peptide < 15kDa
Auswertung des Molekulargewichts
Kalibration
Relative Mobilität gegen log Molekularmasse ergibt lineare Beziehung
Kalibration mit Polypeptidenbekannter Molekularmasse
SDS-PAGEBeispiel Gradientengel Coomassiefärbung
Porengrössenverteilung im Gel kontinuierlich ansteigend
gewährleistet hohe Trennleistung und Schärfe über weiten Molekularmassenbereich von Proteinen
Visualisierungunspezifische Färbungen
Allgemein erfolgt nach der PAGE eine Fixierung der Polypeptidbanden mit Alkoholen/Säuren oder durch Blotting
FärbungCoomassieblau-Färbung (> 1 ng pro Proteinbande) siehe auch
Bradford-Assay
Silber-Färbung (20-200x sensitiver)
# Verstärkung der Ag+-Bindung (Glutaraldehyd)# Ag+-Imprägnierung# Waschung# Entwicklung: Ag+-Reduktion zu Ag am Protein
Visualisierung der Polypeptidbandenunspezifische Färbungen
Visualisierungweitere Varianten
Enzymaktivitätsfärbungen
• nur bei nativer PAGE
• künstliche Substrate / Cofaktoren
• Bildung eines unlöslichen Produktes in der Enzymreaktion
Autoradiographie von markierten Proteinen
Western-BlottingPrinzip
Immobilisierung von Proteinbanden durch Transfer aus dem Gel auf proteinbindende Membranen
spezifische Polypeptiddetektion auf der Membran meist per Immunodetektion, die in PAGelen nicht möglich wäre (MG)
Transfer wird meist elektrophoretisch durchgeführt(Elektroblotting)
Typische Membranen bestehen aus Nitrocellulose, Nylon oder PVDF (Polyvinylidendifluorid)
Western BlottingDurchführung
Antigen-Antikörper-Reaktion
Antikörper -Aufbau -Konfigu- ration
Paratope
Antigen-Antikörper-ReaktionAntigen-Determinanten
Epitope
ImmunodetektionAblauf
Primärer Antikörper
SekundärerAntikörper
Nachweisreaktion
ImmunodetektionNachweisreaktion
Ausblick