Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome...

Post on 15-Jun-2016

214 views 2 download

Transcript of Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome...

�������������� �� � ���� � ������� ������������������ �������� �� ����� �� ��������� ���� !�"#����$�� ���� ������������ � %���

&'(%�� �%�%�) *�%�( �+ (,���) �-%�.'��/�, �+ %�**0) *1'2/� *+ 1�..�%) ���%'�( .+ '&�%3�,

��� ������� ��� �� ������ ��� ����� ���� �������� ���� !�"""

�������� � ���� ����� ������ � ����� ����� �������� �� ������ ����

��3�%���4 ��������� �������� ����� ������ ��� �� ����� �� ��������� ��������� �� ������� ��������� ������� ������� ��� ���������������� ���� ��� ��������� � ������ ������ � �� � ! "�� ������ ������� �������� ��� ��#������� ��������������� ���������� ��� �#$���� # �� �������� ��� ��%������ �������� �&� � ��� ����� � �&'() �*+�� ,�-! "�� �&� � ��������� -)& �� �./&'0-1 �(�&�*2""2�2222*�"*2"*2*&,��� ����� ��� ���������� ����� �� ��� �� �����#�� � 3)4 ������ �������� � �� �! ���� ��� �� �������� ,!) �56� �./&'0-1 ��)!0 7 ������ ��� � ���� ��������� ��8����� �� )!( 7 ������ ��������&��##��������� ��� ������ � �������� #������ � ! "�� ���� ���� ��� ���� � ��������������� �� � ����� ������� � #������� �� ������������ # 39!94 �� � ���� # 0) ������� -' �! / ����� �������� # ���� ������ # ��� ������ ���� ���� �./&'0-1�� ������� � ��%�����&�����$� ������� �� ��� ����� ����� �&���� �� ���� ��������� ���#����� �6��: ���#������ ���� ������ ������� ��*���� ������ �0���� �(,! "�� *+�,�- ��������� --& � �./&''3- �(�&2�2*"2���2*�22"*&*�"***&,�� ������ � ��%�����&��������� ������� # ����� ����� $��&#�� �� ����� ���� *+�,�- ����� ������ ��� ���� ���� �� ��������� �������� �� -' � #�&����� �� �� ��������� �� � ��� # - �56�! /� �� �������� ���� �� �� ���������# ���� ��� ������� �&� � ��� *+�,�- ���� �������� �� �� ���� �� �� ���������&����� ������� # �����! "���� ������� ��������� ��� �������� # ������ ��� #���� �� ���� �� �������� ���������� ������! � -))- ;����&7���� /��! ��� ��� � �����

��� ��������� ��������� < ��� =�� >0:0))>?0)09� -))-

�������� ���������@ �������� ����� �����@ �� ��������������@*+�,�-@ ��

',�%�*-��'�,

�������� ����� ������ ���� ������� �� ����&�������� ��������� ������ ����##� ��� ������ # ��#� ��� �##������ ������ #� ��� ���� # ��������!0?, "�� ��� ���� #���� �� ��##���� # ��� �� ���� ��� ����&���� ����� �� ������� ���� ���& � ���� ������ ��� ��� ��� ����������� ���6������ ������� ���� ������ �������� �����

���6���� �A���� 0�! ��������� �������� # ������� ���� �� ������� �� ����&#�� �������������� ��' ������� ����� �� ����(�1 ��� �� ��� ��������� �� ����!3?> "���� ��� �� �� �������� ��� ��� ���� �� ��� �� ��������� � ����&����� �#�� ������ ������ � �� � !0) "���������� ��������� # ����� ��� �� � ��������� ���� �� ���� �#$���� ��� ������ � ������� ������ ������� � ���� ���� �#$���� #�������� �� ���������!"�� �� � # ��� ������ ������� ��� �

����������� ��� #������� �������������� # � -)& � �&� � ��������� ���� �./&'0-1� � ���� ��!�! �� ���������! A����� ����� ������� ����������� � �������� ������������ ���� �� ����

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ���� ���

������������ ��: .�6� �� �"�������: ('0&3(,&,1,(@ A��: ('0&3('&,('(@ B& ���: ���C�����!� �

<���� # ��� ��������� =�������� .�! >0� 0))>?0)09 �-))-�� -))- ;����&7���� /��! ��� ��� � ����� ��� ��������� ���������

�#$���� �� �� �������� ���� ����� ������ �� ����� ����! "�� $�� ��� ��� ��� ���������� #���� ��������� #������ 3)4 ������ �������&� � �� � �� �� �� ��������� # ��� �&� ���������� ��� �./&'0-1! "�� ���� ��������� ��� ��� ���� ����������� ��������D���00 ������ ������� # ���� ��� �� ��� ������ ����� ������� � ��� �������� ���� �&� � ��� ����& ��� �� ����������� �������� �� ��� � �� ������ ��� �� �� �������� ������� #������ 3)4� !0- "�� ����� �������� ��� ��� ��� �����&��� # ���� ����� � �&'() �*+�� ,�- ��D� ��������� �� �� �� ��������� # � --& � �����./&''3-� ����� �� ��������� � ��� �� *+�,�-!=������ ���������� ��� ��� # ��������� ����&���� �� ��� # ��� ����& ������� �� ���� ���� �� ��������� �� ��� ��������! /�����&������ �� ��������� # ��� ��� �./&'0-1 ������� �������� ���� � ����� �� ���� ����&������3 ����� ������������ �� ��������� #� ����������� ������������ ���� � ��&%����� �� ��� � ��� ��� �./&''3- ��� �������� � ������� �� ���� *+�,�- ��D� ���������!0,

"�� ������ ������� ����������� ��� �##��� #�������� ������ # ���� � ��� ����������&���� ����� # � ��! "�� ������� ��������� �������� � �������������� # ���� �� ��� �� #�&����� �� �� ���������! A����� ���� ���������� � ��� �������� # #���&������ ������ ��� ���� � ��� ��� ����� ��� ������� �� ������ ������� �� ��� ����� # ��� �� �������� ����������� ��&��� ��� *+�,�-� ������������ ��� ������� ������� ��� �����!

����%'�.3 �,* ���/�*3

������

���� =�����&������ ��� �=� ����� 2����*��� �������� ������� -))?--( �� ��� ������� ������� ����� �� ��� 7����� ��� �� ��&����� A������� �� ���� =���� E�������� ��=E��� *������� ��! "�� ��� ��� ��� ��������� ��� ��� ���&������� ���� 0-&� �����5��6������ ��� ������ ������ � � � ����� �� ������ ��� ���� �� ������! "�� �� � ����� # ������� 8����� ���� ��� ��� ���� # ��� ��&6������ ����� ���� �������� ������� ������� �F���� ������ ��������� ���! ��� ��� ������� ��# �� � ��� ������� ���������� #��� 0>3( ��������� # �����6� ��� ��� ��&���� �� ��� GG/����������� ��� �� *�� ��� E��* �����HH # �=E!

������� /���������

"�� ������ ��� ��# �� ����� ������� ����&��%�� �� �������� ��������!0' ���� ��� ����&�����D�� ����� ��I���� ������ 7���!� ���*������ /7� ��� ���� ������ ��#��� ��� ���������� ��� �����&���� ��� ������� ���� ����&����! � ������ ������� ��� ��� � ����� �������� ��� ��� ����� ��� ��#� ������ ���� ���������� ������� ��� ���� �������! "��� ������� ��� ��� # ����� ����� 1( � 3)4 # ��� ��������! "�� ��� ���� �������� ��� ����� �� �������!

������������������ ����������������� 5���6 ������������

��� ���� ��� ��������D�� �� �./ J���� ��*������� ��� �� �������� ��������!, =�&%������ # ��� ���� �� ���������� �� A���� 0!����� ��� ����� ���� >)4 #��� ������� ������ ���� �� �����&����� �7* ��� ��7�/&"�A ��� ���������! 7������D�� ��� � &����� ��� �������� �� ������ ��������&��##��� ������ � 3!' ��� $����� �����)!-&� ������ $���� �2�� ���! ��� ����������� ������� ���� ��� �� �������� ������ � ������ ���� ������ �� )!( 7 ��� � ��� ���������� ����� ����� ��� �� #������ ���� # ���#������ �� ������: 01 ����� ��� ���� - ����������� ���� � , ���� � ��� ��� �"� ��=������$�� =������� �<�! ��� ��� ���� �����&�� ��� ���5������� ����������� ��� �� ����&���� ��� �� � ����� 8����� ���� ��� �� )!0

����� � *�� ���� ������� # ��� ��� ���6������������� ���& � ���� ������ ��� ��� ��� ��&���� �������� ����� ���6���! "�� ���� ��%�����# �� ��� � ��� �� # 2�����6 �������� �� ��+)),>1 ��� ��� ���� ��%����� # �� *+�,�- ��� ��# 2�����6 �������� �� �� E)>3'-! "�� ��&%������ # ��� ��� � ��������� ��� �./&'0-1 ������ *+�,�- ��������� ��� �./&''3- �� ���� �� ������������� ����� �� ��� ����������! J��� ��������� ��� ����#��� �������� �� ������! ��� ���� �./&'0-1 ��� �� �� ���� �� ��� ,� ���! "�� �./&'0-1��%����� �� �������� � �� � ������� � ��� ����� ��� �� ��� � ���!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

7 ������ ������! *��� ������ ��������� ���� ����� � �������D� ��� ��� �� ��� ��� # �������� ����!

���������������

���� ������ ��� ������ �� ������� ��� $�������� � ������� ���� # #D�� ������ ����&���� �=�6�� A�����6� "����� *��! "�� ������ ���� ������ �� ��� #�� � ����� ��� # ������ ��� #D�� �� � �9)�* #��D�! *����� ���&���� �( �� ��� ��� �� �=E .������� ���������7����� �*������� ���! =����� ��� �� ���� ����� ��6 # ,) �� ��� ������� ����� �����A�� ���&2 ������ ���� �=�����J��������� ���������� J� ����� � �7�! "����� ������� ��� ��6�� ���� � ��6� ���&��� ,)) ������ �������� � �� ��� ������������� �+� �����$� =�&���� ������� �� ��!"�� ������ �� �� ��� 6��� ������� # ���I������� ������� �� 0, �!

'��7����� ������

7����� # ��� ������ ��� ���� ���� �� ;������ ������ ���� ���� �������� ������ *+�,�-��������� ���� ���� �� ���� =&> #������! "������������ ��� ������ � �������� �#�� ��� ���������D���� �� � ����D��� ������ �� �������##� �0��J=� 04 ������ �&')� )!(4 ���� ����������� )!-4=�=�! * �����"����� B�"�&#�� �J������&������� � ������ ���������6���� ������� ��� ����� � #��� ������� ��9 75������! ��������� �� ���� ��� �����#������ 0(�)))� � # -) �� �� '�*� ��� ��� ����&������ ��� ���� �� �9)�* ����� ���! ��� �����&��� ��� ���������� ��� �� #���� ���� #��D�&������ �������! A�#�� ���� � # ���� �������� �������� � � 0-4 ���� ���������#���5����� ��� ��� ��� � �������� ������� �������� ������%��� �� �������� ��#�!3 ��&����� �� �� ��������� # �&��� ����� *,,�������� �0 ����� *-)�� ��� �*�� ����� �*0)���� ������� # =���� *�D J����������=���� *�D� *��! �&����� ����� �*&')� ��� # =�� �� �(, ��������� ���0� ��� # �������������� ������ �*� ������ ���� ��� *+�,�-�������� ��������� ��� # 2������ �;�������! �&����� � ���������� ��� ��# �� ���$ ���� ��� ����� ��� ����� ���� �� ���� ���� # ����� �� �������� ��� �� � ��� ��0)) � -& ������������ -4 =�=� 1-!( �"��& *�� � 1!3 # 0 � �� ()�*� #����� ����� ������� ��� ���6��� ����� �� ��������!

������ ��� ��� ��# �� � � K��6 / ���=����� '') ��B�� J���� ���!

����7����� � ��������� ���� !�" 5�0�!�"6

"�� �������� # *+�,�- ��� ������ �� ��������� ���� �� ��������� �B��B�� �����!0(

"�� �� ���� ��� ������ �� ����� 0!) � #=&> #����� ������ )!' � ���� �����=�� ��� ��� 0!) � ���� �=�� �� �� � $������ � # 0 7 �� )!0 � ������� ����������##� �� � 3!'�! "�� �� ���� ��� ��������� #0( �� �� ,3�*� ���� ���� )!( 7 034 ����������� �=�� �� ��� �����#���� � � <��� �����&#��� �� 0(�))) �# # ( ��! "�� �� ���� ��������� �� � ��� ���� ��� ���� ���� )!' � ���������� �)!)- � -�'&������������ )!14 �5�������� ������ ����� ��� ,!> � � ��� ����������� ��������� �� 3)�* # -) ��! "�� �� ������� ������ � �� ��� ��� � ��� ��������& ��� �� '0- � ! ��������� ��� � ���� � �������� ���� �������� # 6��� �������&���� # # ��������! ���������� ��� ������� � � # ��������5 � �����5 ��!

/�.� *������� � ��� � ������ �� .���� ����7�

� 0)&�7 ���%�� �()) ��� # ��� ������� ���������� �0(& � ���� ��%����� ��� ������ # �(� �������� # �./&'0-1� ��� ����� � ��� -() �7���%��� # ���� � ��� ���� ������ �)!- �5 7��� ����! ������� �,)) �7� ��� ����� � ������ ��� ��� ��� ����� ��� ������! "�� �������� �����#���� # 0) �� ����� � ����&����������#��� ��� ����������� ����#��� � ���B�����# �����! "�� ������ ��� ���� ���������� 0)) �7 "�� � 9� ��� ��� ���� ��##� �������� � ��� ����������! "�� �������������� ������ �� � ���� ���� �� 3)�* # 0) ��!"�� �� ���� ��� ������#���� # 0) ��� ������ ����������� ��� ����#��� � ��� B����&�# �����! ������� ��� � ��� ����� � ��������� ��� ��� �� ���� ��� $����� ����#��� ����� ����� ����� ��� �������D�� �#�� ��� �������# 0)) �7 # �����D�� ���� � ���� ����! "���������D�� �� ���� ��� ����������� �����0)) �7 ���%��� # (�&I����������� ��� �0!)�!�! �����5 7� ���� ��%����� ��� � ��� ��&��� � ���� # �./&'0-1 ��� ��� ��� ��������������! � ��� # �./&'0-1 �������� ��������� �� ���6��� ��� ��� ��� -() �7 ���%���# ����6 �� ���� � �0)� -(� ()� 0))� -()� ())���� 0))) ��5-() �7 # ���� �� ���� ���� ���������� �������! "�� �������� ��� �� �������������!

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= �

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

"�� �� ���� ��� �����D�� �� ��8������ � � ������ ��� ��� ��&0)) ��� � �'� -()& ��� �@ ����� *������ =��������� *������� � .���� ����� ��� ��/&-))� ��������� � .���� �7* �� � � ��� >)0) ����� �%���&��� ���� � .���� I������� ������ � ���>)3(�! "�� ���� ������ ��: )!)-( � "��� � 9@J: )!)-( � "��� � 950!) � ��*�� ��� ����������� �7*&���� ���� ��� ������� ��� $�&���� ����� � )!-& ��� $��� �� � ���! "��������� ��� � ����� ��� L>)?0)4JM ��) �� ��� L((?'(4JM �� -) �� ����� ��� �� ���� ���� �� � I� ��� # 0!( 75 ��! "�� ������ ����� �� ��������� ��� � ����� ����&������� # '>' ��� (09 � � �����������!

������ � *���

"�� ���� ��� ��������� ���� ��� ���������� #��� � ���� ��� �K*�7* �� �����������������!01 "�� /. ���� � ���� ��� $� ��%! 0:03

���� � ���� � !���� �0����� ���� �� ��� ���� � ���������� �� �� � �� � ��� ! �� �������� �� �� � �� � ������������� �������� ��� � �� �� ��� ������ ��� ���&����! ��� ���� �� ����� �� �����=B� ������ ���� �� ��� � ���� ��� /�=���-�2������� =�� ����� *��! 2���� ��� ��&���� ���� ��D �-!) �2�������!

%�3-.�3

�&'��8"9 �� *��������� � ������ �� .���� ����7�

7��� ������� # 3)4 � ��� ������ �������� -!( �56� I�������&������� �./&'0-1 ������ ���� �� ����� ������ �A���� -*� ���I�������� �A���� -�� ������! "�� ��&����� ������� ������ �������� �����������I�������� ���� ��� ������ �� �� ��� �������# ��� ������ ���� ��������� �./&'0-1�A���� -� ��� J�!���� � ��� ���� ������ �� ���� # ���

������ ���� ���� �./&'0-1 ��� ������� ����� � �7* �� �������� �� ��� ������ ������!"�� ������ �� # ���� �� ���� �A���� ,� �� �./&'0-1� ��� ������� ����������� ��� I����������� ��� ��� �� ���� � �����!������������� �� ���� � � ��� �����&��� # ���6� # ��##���� ���� # �� ������&��� �� �������� �� A���� ,!

"�� ���6 ��������� � #���&������ �-)& ���./&'0-1 ��� ������ ������ �� ���� � �� ����# ��� ������ ���� �!�! ���� ,!) �56��./&'0-1 �� � -' � #������ �� ����������A���� ,*�! "�� ���6 ��������� � #���&������ �-)& �� �./&'0-1 ��� ��� ������ ������������ ���� ������ ������� -' � #�������� ��������� �A���� ,��! "��� ���������� ����&��%�� �� ������� # ������� ���6� �������� # ��&0�& �� ��� �������� ������ # �./&'0-1���� ������ ��� �������� �� ���� � ����������!

����� ����������� �&'��8"9 /�� /��������� ��������������

J�� �� ���� ��� �������� # ��� �������!�! ���� ���� ,!) �56� �./&'0-1 �� ) ���0) ��� ,) ��� 0 �� - �� ' �� -' �� ��� '9 �! �./&'0-1 ��� ���������� �� ��� �� � ����� ������ '9 ��� ��� �!�! ��� ���� ������ ����! "�� ���6�# '9&� ���� � �� ���� ��� ���� ��� �����&��� �� �� # ��� ���������� ������%�� ����������� ��� ') ��5 7�! "�� ������� ���6 ���� #���� � �� ���� ��� %���������� ����� � ����&��� ���� �-� )!>>>-,� ���� �� ����� � ���&������ ���� � ����������� �*�� # �./&'0-1�A���� '�!

����� �� ������������� -))� ���� ��� ��&����� # 3)4 � ��� 09 � #������ �� �� �����&���� # -!( �56� �./&'0-1! ��� J� ����� ��������� I������� � ����� ������������ # �� ���������$��� # �./&'0-1&������ ��! �*� �� ����� ��������� I������� � ����� ������������ # �� ���������$��� # I�������&������� �./&'0-1&������ ��!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

"�� ���� � ���������� ������ ������ #��� �!�! ��� ���� ������ ��� �� �������� ��"���� 0! ��� �� ��������� ������� �� � ��� �# ���������� � -!-� )!- 756� � ���� �0!9� )!1 756� �� /!.!&������ ��� ��� ��� )!)(��� ��##�����! "�� ���� ���� ��� ���� � ��&�������� ����� �� �������� �� "���� -! "������ # ��� � ����� ����� �0) �� � -' ����� 03!-� 0!) ��� -0!9� 0!' ����5 � # ������� �!�!&������ ���� �����������! "�� ��� # ������� ���� ��� ���� � ���������� ����� #�� � /. �0) �� � -' �� ������� �� ������ ���������������� # 39!94! "�� ������ �� ��&������������ �������� � '3!, ��� ')!>4 �������� ���� ��� ����� ��� ������ # 0) �� � ' �� ��� 0) �� � - �� �����������!

����� ����������� �&'��8"9 ��7���� 3�:7����*������ %��7���� � ���������� � %��������� .����

/ ����� �������� ��� ��# �� � ����& ��� �&��� ����� ������ �� #��� �� �����������! "�� �&��� ����� ���� ��� �������� ��������� # ���������� ����� ' � #������ � �A���� (� ��� J�! 7����� # �&��� ����� ���#��� � �� ��� �� �� ���� ������� # ��� ���� ����� ����� � ��� ��� �� �##����� �� ����& ��� ���� �./&'0-1! B������� ������ # �&�������� ��� �������� ' � #������ � � ������ ��� �������� ������ �� ����� # ��� ���������� �������� -!( 0-!( �56� # ��� ���� ��&� �! "��� ��� ���� �������� # ������� # �&��� ���� ��������� ���� �./&'0-1 ���� ��������� � ������� ���?����� ��������� ��� ��������! "�� ������ ������ � ������� �� )!0 �56� ��� ��� ������ ��������� �� 0-!( �56�!�&����� � ���������� � ��� �� � ���� �&������ �� �� ��� ���� ����������� �� ��� �������$ ��� ��������� ������ # ���� ����� �� ��������!

����� ����������� �&'��8"9 ��7��� 3��������%��7���� � 3������ ���;�� ����������������� 1��� ���� � %��������� .����

" #���� ��������� ��� �����$���� # �./&'0-1��������� ��������� ���� �������� ������ ���&����� �� �&� ���� ��� ���� �� ��� �������������� ������� � ���� �� ������� �6��!�*�� �� � � ����� # ��� ��� ��� ���� ���� �� ������� ������� # ��� �����������������!09�0> *����� �0 �� ��������� # �������

����� �� ������������� ���� �������� �7*�� ���� � ������ �������� # ��� ��� ��./&'0-1 �� ��� ���� ���� � # �������� �� ���6������ �./&'0-1 ���6 ������@ �J� ���� � # �� ,) ��#������ �� ���� # ,!) �56� �./&'0-1@ �*� ���� �# �� -' � #������ �� ���� # ,!) �56� �./&'0-1@��� ��� ���� ������ # �� -' � #������ �� ���� #,!) �56� �./&'0-1! "�� ������ �� # ���� �� �&��� �� �./&'0-1 ������ ����� 01 ���� ��� 0(& �������� ������� ������ ����� 09 ��� #������� ������ I����������� ��� ��� ������ �����-, ���! =�� ��� ������ ������ # � ��������� # ���������%��!

����� �� ���� � ���������� # �./&'0-1�������� �� ��� �#�� ��������� ���� �%����� �� �� ��������� �$���� �%����� # ,!) �56� ����!J�� �� ���� ��� ���� �� ��� #������ �� ������:0) ��� ,) ��� 0 �� - �� ' �� ��� -' �! ���� �� ��������

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= ��

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

����� ��� ���� �����@-) ����� �(, �� � ��������� ����6���� ������ ��� � �� ���� #���� ���� ������� � ��5 �� ������� ����!-0

"�� ������ # ��� ���� ������� �6� ��������� ��� ���� �� � ����� �������� �� �������# ���� ������ �������� -' � #������ � ! ����&��������� ���� # ����� ����� ���� �� ��&������ �� A���� 1! �� ��������� ��� ���� ����������������� ��� ��� ������ # �&��� �����!��� ��� ���������� ��� %���� �� �� ���������&� �D�� �� ������ ��� ��� �� �##����� �� ����& ��� ���� �./&'0-1! �� �������� ��� ������-' � #������ � �� ���� ��� ���� ��� ���������� ������ )!( �56� ��� ���� �./&'0-1!/�������� ���� # ��������� ��� �./&'0-1������ � ���&��������� ������� �� ���� �����&������! �&����� � ���������� � ��� �� � ����������� �� �� ��� ���� ����������� �� ��� �����!

����� ����������� �&'���<" ��7��� � 3��������%��7���� � .���� �0�!�" ������ .����� �� 1��� ��#7������ �0�!� �=�� �������

��� �� ��������� # -!) �56� # ��� *+�,�-��������� ���� �./&''3-� ������ � $��& �����#�� ��������� ��������� # ��� # ��� *+�,�-����� �� ���� ���� �� ������ ��� # �� ����=&> #����� ������ � ����� �A���� 3��

���� ������! � ������� ��� ���� �� ��� ������# �� �������� ������ ���� ����������A���� 3�� ��� ������! ������������ �� ������&��� # ����� ����� $��#�� ��� ������ �� ������� ���� �� ��������� ��������� �� ������&� # *+�,� #�������� ��D� � ��������� �� ����� � �� ���� �A���� 3J�! "�� �������� # ���� =&> #������ # ���� ���&������ ��� �&������ � ������� �� � ����� ������ ������ ����� � ������� # ����� ����� 0,4 ��*+�,� ��D� � �������� � ���� � �����������!

*'3�-33'�,

"��� ����� ���������� ��� ���� �� ��������&������ # ����� ��� ������� �� � ����� ��������� ��� ���� ��� ������ ��� # ����� ����&����� � ����� �� ���� �� �������� ����&������ ������! E��������� ������������ ����6��� #�%������ ������ �� ����� ��� ������ � �����6� �� ������� ����� �� ����������� ����������� # ����� ��� ��� ��������� ���&�������� ��� ������! ���� ��� �� � �������� �� ���������� � ��� ���� �� �� ������� #����������� 6����������� ��� �� ����������� ����� ���� �����$���� ����6� # ����

����� � ���� � ��� ��6������ ��� ���� A������ J��� �� ��������� #,!) �56� �������� ����� ������ ���� � �./&'0-1 /���������� ������ ���� ����

��� ����!�!

�� ������������

�� ���������

��� # �./&'0-1 � �56�� ,!) ,!)�� �� # ��� ��� �� ���� ��� ��� ' '.�� � # ���������� �756�� �� ������ ����� 0!9� )!1 -!-� )!-���� � �������� � 75 ��� )!>3� )!0' )!1)� )!)>"�� ��8����� ��� �� ��� )!0 7 # �!�! ��� )!( 7 # ��@ ��� ������� ��� ��������

��##��� ������! ��� ������ �� ���� ������� � # ��� ���!

����� �� ���� E��� ��� ���� � *��������� *���� A������ J����� ��������� # ,!) �56� �������� ����� ������ ���� � �./&'0-1/���������� ����� � ���� ����

��� E��� *��� �!�! ���N�5 7� ��� ���N�5 7������� ���J�������������

0) �� � -' � -0!9� 0!' 03!-� 0!) 39!940) �� � ' � 0,!0� 0!, 1!-� 0!) '3!,40) �� � - � 00!)� )!> '!(� )!' ')!>4

��� ������ �� ���� ������� � # ��� ��� ��� �� ' # ���� ����! "�� ������ ���������������� ��� ���������� �� �������� ��� ���� # �� ���� ��� �� ��������� ���� ���!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

#������ ���������� ������� ������������ ���&�������! "�� ��##������ ������� �� �� ���&����5�� ���� ������� ����� ����������� ���������� ��� � ��� ��������� # � �������� ��������&���� ������� � ��� ���� � ���� ���� �� �������� ��� ������� # ����� ��� ����������� ���&����! "��� ��������� �� ����� �������� ������ �������� ����� ��������� � ��!"�� ���� �������� �� ���� ����� �������� ����

���� ���� �����$���� ���������� �� ��� ��&���������� ������ # ��� ���������� # ����� �������! ���6��� �� ��!-- ���� �����)!,4 �������������� # ���� �� �������� ���&�������� ������������� �� � ���� # 1 ������� ������ ��� F����-, ���� ����� 03 �,(4 �������������� ���������� ������� #��& ����� # ���� �� �������� ������������������������! ������ �� ��!-' ���� ���

����� �������� # ������ ��� � �� �� ���� ���� ������� #������ �� �� ��������� # ������ -�&�& ������������������� �� � ���&������ ���� ��� # () �56�! =������ ���� ����&���6��� ������������� ���� ��������� -( �,>4 �������������� #������ ��&�� ����������� � ���� # 0- �!-,�-( ���� ������ ���#����� � ������� � ������ �� ��� ����������&���� ����� ���� ���� ������ # ����&���6���������������� ����� �� ��� ��������� �!-1

"�� ��� # ���� ���� ��� ���� � �������&��� ����� #������ � ������ ���� �� �!�!�� ��������� # �./&'0-1 �� ��� ������ ������"���� -� �������� ���� �./&'0-1 ��� ��� 39!94������������� #������ �� �� ��������� ��� ���� # -' �! � ����������� ���� # ���39!94 �� �������������� $��� ��� � #

����� �� ������������� � ����� �������� #�&��� ��� �&����� �� �� ���� �������! ���� ��� ��������������� �D�� ������ � ���� # ' � #�&����� 3)4 � ! "�� #������ ��� ���� �� ���� ����& ���� ���#� � ����� �� �������� ���� � ��� �� ���:�0� �J=� �-� )!( �56� �./&'0-1� �,� ������� �'� )!0 �56��./&'0-1� �(� )!( �56� �./&'0-1� �1� -!( �56� �./&'0-1� �3� 0-!( �56� �./&'0-1� ��� �9� -!( �56����� ��� �! "�� #������ ��� ���� �� ���� ����& ���� ���#� � ����� �� �������� ���� � ��� �� �J�:�0� �J=� �-� 0-!( �56� ���� ��� �� �,� 0-!( �56��./&'0-1� �'� �J=� �'� 0-!( �56� ���� ��� �!������ ��� ������� # ��� � ����� ����� ��������� ������ �� ���� ���� ��������� �����! ������� ������ ��� ������� �� � ������ ���������� ����� ���� � ������ ���!

����� �� ������������� � ����� �������� #���#������ ���� ������ �������� ������ �0 ��� �(,�� �� ���� ������� ���� ��������� �&����� �����! ������� ����� ���������� �D�� ������ � ����# -' � #������ 3)4 � ! "�� #������ ��� ���� ������ ���� ���� ���#� � ����� �� �������� ���� ����: �0� �J=� �-� )!( �56� �./&'0-1� �,� �J=� �'�)!0 �56� �./&'0-1� �(� )!( �56� �./&'0-1� �1� -!( �56� �./&'0-1� �3� 0-!( �56� �./&'0-1� ��� �9� -!( �56� ���� ��� �! ������ ��� ������� # ���� ����� ����� ��� ������ ������ �� ���� ������������� �����! ��� ���� ������ ��� ������� ��� ������ ��� ������� ����� ���� � ������ ���!

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= ��

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

������ ��##������ �� ��� ���� � ��� �������&���� �� ��� -'&� �� � ���� �A���� '�! "��� ����������� �� ��� � �#I�� # ��� ���� ���� �������� ��� ���� #������ �� �������! "�� �������&��� # �� �������������� �� ��� ' � ��� - � �� ������ ���� ���� # '3!, ��� ')!>4� ������������"���� -�!"��� ����� ��� ���� ������� �� ���� #���&

����� ��� ����� #������ �� �� ��������� #��������� ��� ������ ������� � �� ������������� �� ��� �� ����: �&� � �� ��� 3)4 � ������� *+�,�- �� ��� ������ ����! "�� $�� ��� #���� ��������� #������ � ��� ���#��������� � ����� ��� ��������� �������� # ��� �&� � ��������� ��� #������ �� �� ���������# ��� #������ �����: �0� ��� �������� # �&� � �� ������ ������� �� ��� ���������� ���������� - � #������ 3)4 � @0- �-� ���� �� ���6��� � � ���� ������� ���� �� ��8��� ���������� ��� �������� # ���� � ���� ��� ����� � ����@ �,� ����� ��6� �� ��� �����&��������� ���� � ���� ����� �� ��� ���� #����������� �� �� ���������@ ��� �'� ��� ��������� #���������� ��������� ������� ��� ���������&����� ���� ��� ���� ������ ���� ��� ���� �&����� �� ��� ����! "�� ���� �� ����� ##������� ��� ����� � ��� ����� ��� ���� �� ����

������ ��������� ��������� # *+�,�- �� ��������� �� ����!"�� ���� �� ���� ����� ����� �� ���������&

����� ������� # ����� # �./&'0-1 ���������� # �&� � �������� �� ��� �� ����&������ ����! "�� ������� # ��� �� ����������� ����� ���� # ���������� ���� �����$ �� �� ����� I�������� ��� ����&��� �A���� -�� ��� �7*&����� ����� #������ ��� �A���� ,*�! � ������� �� ��� �����# ��� ����� ����� �&��� ��� ������ �� ���%�����&�����$� ���� ��� ��� ��� �����&���� � � � ������ �A���� '�! A����� ��� ������# ���� ������� �6� ������ ��� ��� &���� � ��� �� ��� ���������� # �������$��##����! "�� #�������� �##��� # �&� � ���������� ��� ��� # ���#����� �� ��� �������������� ��� ���� ���� �� � ����� �������� #�*��! "�� ����� # ���� ������ ����� ��� �������� ���� � �� �� ������� ������� # �&��#������ ��������09 ��� #��� � �� � ������� � ��������� �������� ���� �� ��� #, &��� ����� �� ��� �� ���� ��������� ���!0> ;� ������ � ���&��������� ��������� �*�� ������ �� ��� ���������� ���� �� ��������� ���� �&� � ��������� ��� �./&'0-1�A���� 1�! =� ��� �##���� ��� ���� � ��� ������# *����� �0� � ������ # ���� ����� �������-)

��� �(,� ����� ��� � � �5��" ������� ���� �� ���� �� ����!-0

"�� ������� �� �������� ������ # ��� ��������� �� #��� ��������� ���� ��������� �����&������ �������������! ����� �� �� �� ����&�� ������� ���� ���� ������ ���� ����������������� ����� ����� ���6��� # ���������'

������ �������� ����� !-3 /� ��� ������������ ���� �� � ���� ����� ��� ��� # ��&��� ��� 0?��� - ������ �*� ������� �����./&'0-1 ��� ����� ������ �������� # ����� �� �&��� ��& ��� �� �7� �����!1 ;� � &����� � �� ��� ������ ���� �� ���� �&����������� �� ������� ��� ������� # �./&'0-1���� #����� � ��������� ��� �������� # �������������� ����� �� �����! "�� ��� ���� ����# ����� ����� ���� ��� �� ������� �� �&����������� ������ #������ 3)4 � � ���� � ��&����� ��##������ ������� ����� ���� �������! "�� ���������� # �&��� ��������#������ 3)4 � �� � ����&������� ���� &����0- ��� ������ ��� ��� ����� # ��� ��� #���� ����� ����� ��� �� ����� �������! "�� ���6# ���������� �� ��� �� �&��� �������� �� ��&����� # �./&'0-1 �� ��� ��6��� ����� # �������&�����$� ��##����� �� ��� ��� # ��������5������

����� �� ��� / ����� �������� # ��� *+�,�-����� ��� ���� ��������� ��� �������� ������� ���� =&> #������ # ��� ������ ���� ���� ������������ ��� �� ��������� *+�,�- ���� �./&''3-!������ ��� ������� # ��� � ����� ����� ��������� ������ �� ���� ���� ��������� �����! ������� ������ ��� ������� �� � ������ ��� ��&����� ����� ���� � ������ ���! �J� B��� ������ ��������� �������� �� ���� =&> #������ ���&������ �� �� # ��������5 �5 ��! "�� ����� ���# �� ��� ��� �� ��� ���� �� ��������� � ��� � & ����� �� ���!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

������ ������ ����� �� ������ � ����� ���6���# ��� � �� ������ ������ �� ��� -!"�� ���� �������� �� ���� ����� ���� ���

��� �./&''3- ��� ������ �� ���������&����� ������� # ����� ���� ����� � *+�,�-��������� �� ��� ������ �� ���� #������ � ���������� �� �� ���������! =&> #������ # ������ ���� �������� -' � �#�� ��� �� ������&��� ����� � ��%�����&��������� ������� �� ���*+�,�- ����� �A���� 3�� ��� ��D� � ���������A���� 3J�!"�� �� # �� �� ��������� �� ���� �� ���

��� � ��� � ������ # ��� ������� �� ��6��� ����� �� � ����� � ���� � ��� ��������� # ������ �� �������� ��� �� �� ������ ����� ��������� �� ��� ��� ��� �����%���� �������# ��� ����������! "���� ������� ��� ��������� ��� �D� ��� ������ # ���� �� ������������ � �� � �� ��� �� ���! "��� ����� ������ �� ���� � ������� ���� ��� ������� #���� �������! ;� ���� ���� � ����� ��� ��I����� #�� � �� ������! A���� �� ���� � ��� �D� ����##��� # �� ��� ������� �� �� ��������� ������� ���� 0) �! ! =����� �� # ��������� ���� �� �������� ���� �� )!( 7 ���&�����&��##��� ������ ���� ��� �������� ��������� �������! �� ������� ����� �� �������# ���� ����� � � �������� ������ � �����&������� # ������� ���� �� ��������! � ����� #�������� �������� ���� ��������� ��� �� ��&������������ # ��� ������������&������ ������� �� ��� # � ���� ��� �� ��� ��&��#&#���� ����� # ��� �������! ������ ��� F����-,

��� �� ��������� ,) � () �56� �����&������5 ����&���6��� ������������� ���� ���� # � ������ # -( �5 7 ������ ��������! ;��� �� ��!-1 ��� �� ��������� � ��� #0) �56� ����&���6��� ������������ ���� � ��� # � ������ # ( �5 7 �������� �� ��&������! A���� ������������ �� ������� �������� ��� �� # ����� ��� ��� � # ��������� ���� �������!"�� ����� ���� ��� ��6� � ��6������� ���

������� �� ������ # ��� ������ #������ ��� ����������� �� ��������������! ������� ��� ����&���� ��� ������ ������� ��� �������� # ������������������ ������ ���� ���� �� ���#�� �����& ����� ������%��!"�� ����� ������� ���� ���� �������

#������ ���� � ��� ��6������� #������ ���� ���������� ��� ����� #���� ������ ����� ���� ��������� ���������� ������! "�� ���# ������� #�������� ��� ����� �� ������� ���� ������� # �� �������� ����� ������

��$ �� ���� ��� ���� ��� ������ ������ ����� ��������� ������� !

��(,�1.�*2��,�3

"���� ������� ��� ������� ���� #���� # E����� =����� ������ ����� =������ ������ �� 2�('930 ��� �./ J���� �� *���������! "�� ����� ���� ��6� � ����6 ����� =���������� K�6�� ������� *��� ��./�� ��� �����=�� ��=E .������� ��������� 7��!� #��������� ����������!

%�#�%�,��3

0! =� ��� <! 0>>>! ������ ��������� ���& ��: "�� ���� # �� ����� &����������� ����&���� ����! J���� J����� ���� 0'9>:0'0?0(9!

-! =� ��� <� ;���� �! 0>>3! ��������� �������# ����� ��� ��! ���������� ����������01:99>?9>9!

,! =� ��� <� ;���� �! 0>>3! ������ ����&����� ��� ��: ������� ��������� ��� ���&����! ��������� ������� ���� ��� ��� 3:093?0>(!

'! 2��� *� =���� �� ;���� �� /����� �! -)))!B�������� # ��������� ������� � # �����!������ B�D� � ,0,:0,(?0',!

(! 2���� �.� =����� �2� *��6 �B� "��� ��! 0>>>!��������� ����� ������������ ����� ��&����� ���������� # �&� � ���! ���������������� ���� ��� ��� >:-0,?--)!

1! ��D��6 ��� =� ��� <� ;���� ��� /������7! -)))! �������#������ �##���� # ����� ���6����������� ����� ������ ��������� ������������� ������� �&� �! ��������� ������� ������� ��� 0):01,?031!

3! �� .� K���� �*� = ��� J7� =����$��� �7�=���� ��� ����� �"� ;���� ��� /����� �7! -)))!�&��� ��������� �� ��� �� ���� ��������� ������������ �� # �&� � �� ��������� ����� ��&'() ,� ��������! < ��� ��� B�� "�� ->-:>-0?>-9!

9! �� .� /����� �7! -)))! ��������� ��������&����� ������� � ��� �(, ���� ������ ���� �&�������� �� ���! ��� ����� ��������� -9:0,0?0,9!

>! O�� 2� "��� �� ���� ++� /����� �7� K�D�6 7!-)))! /� ��� ��������� # � ����� ������������ � ������� ������� �� ������ #���&�!��������� ������� ���� ��� ��� 0):00?01!

0)! ��D��6 ��� J�#�6� B� J�#�6� �A� ;���� �7� ���� =J� ;���� ��! 0>>1! ���������� # &����� �������� ����� ��� �� � ��D�& ���� ���������! ������� ���� ��� ��� 1:-13?-3-!

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= ��

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

00! ����������� 2K� ��A����� �*! 0>>3! 7������������! =������ -31:1)?11!

0-! K�� J"� "� ���� < � =��� *<! 0>>1! ����������� ��� ��������� ����� �� ���� ���������!� < ������ -3)�(� �� 0�:231,?2333!

0,! ���8����� <�� /����� �7! 0>>(! /�������� # ����� ����� � �'() ,�- �� �� ��������� ���&�������� ���������������� �� ���! < ���& ��� B�� "�� -3(:01)9?010,!

0'! ������ 2�� ������ ��! 0>,0! �������� #���� #������ ������ ������� � ���! �������� 0-:091!

0(! 2�D���D A! 0>9>! "�� ������ ����� ���&�� � �'()�! ��� ��� ��� '):-',?-93!

01! =�� �6��*! 0>91! �6����: � ����� ���������� � &���� ��� # ����������� ��� ��� ��6�������������� # ����! ��� ����� ��� 03:,,0?,'9!

03! 2������ �� ���� �! 0>9-! ��� ��6�������� -����! ��� +6: ����6 ��66�! �� '(?000!

09! ���� �� 2�� +� F���� �� �������� ��� �������6�� ����6 2+! 0>>9! E�� # ���#������ ���� ������������� �� � �6� # ���� ��������� �#�� ��&���� �������� � �� ���! < 7�� *��� ��� 0,0�,�:-(0?-(1!

0>! A��� <� "� "� ����� �� J������� J�2������� "7! 0>>,! * ����� # ���#���������� ������ ������� � �������� ��� ����� �� � �6� # ���#����� ���������� �� ���! B���� ����� ������� 0)0�=���� (�:0>>?-)1!

-)! =���6��� =B� =���6�� ".! 0>>>! *��� ����� ����# ������ ����� ��� ������ �����: B�&����� ��� �� ������! *�� ��� ,(:>3?001!

-0! K��� B� A������6�� =� �� �# � J�6 ��� ��B���� ! 0>>>! B������� # �� �� �(, �%����

���������� ��������� # ���������� # ��� �(,� �� �� ��&0� �A&6����J ��� ���5���!������� 09:-3-9?-3,9!

--! ���6��� �7� J����� �� 2������� <� *��� =<�*� ��� 77� �������� <2� �������� <�! 0>>9!��� ��� �������������� # � ��������&��� ������������ �*2� 1'0-9��: * ��������� ��� ������� ����! ��� ��� 0(:(9,?(>0!

-,! ������ =� F���� �! 0>>9! ��� ��6������� ����������������� # ��������� ������������� #���&��� �� ��� ������� �� ���������� �� �����& ����� ��� ���! /�: *6� ="� ����! ��������������� ��� ����������� 0�� ��! ��� +6:=�����&.����! �� (-(?(',!

-'! ������ =� F���� P� 7� F� F�� � "� ���� <��+�� <� *�� � ����� �J� ���� /� <���� F� �� ��!0>>(! �������� ������ ���������� ��� �� ������������ �� ��� # � ����� ��������� ��������&���� #������ �� �� ���������! J���� ���& ��� ():(30?(31!

-(! ������ =� /�� ��! 0>>3! ����������� �� ��������������������! ��� ��� "�� 31:0(0?01)!

-1! ;��� � *�� O� F��� P� +� �� ������ =� F���� �!0>>>! ������ �������� ��� ��� ��6������� # � ���� ���6��� ��������� ������������ �������� ��� �/� ������� # ����� 6����� � �#�� ���� ���������! �� ���� ���� =�� E=� >1:0,>9>?0,>>'!

-3! =���� �� A��� B� ���� =J�;���� �� =� ���<! 0>>3! � �����$���� � ����� # #� ��������������: ������� -�&�& ����� ���� ���� �������������� ���! ��������� ������� ������� ��� 3:0(0?0(3!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����