Post on 12-Jun-2020
WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD
OFICINA REGIONAL PARA EUROPA
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de
Alimentos
Sesión nº 10
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM
F. Weighardt
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 2
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
Índice
Sesión nº 10
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM
Introducción 3
Métodos de cuantificación basados en la PCR 4
Historia de las técnicas de PCR en tiempo real 7
Principios de la PCR en tiempo real 7
Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real 13
Bibliografía 20
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 3
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
Introducción
Una vez comprobado que un producto alimenticio ha dado positivo en relación con
una o más modificaciones genéticas (soja Roundup Ready, maíz Bt-176, maíz Bt-11,
maíz MON810 y maíz T25), los pasos analíticos posteriores consisten en determinar
si se cumple la legislación vigente (Reglamento (CE) nº 1829/2003 y Reglamento
(CE) nº 1830/2003) midiendo la cantidad de cada OGM presente en cada ingrediente
(figura 1).
Los Reglamentos mencionados disponen que todos los productos que contengan
OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM deben ir etiquetados
como tales.
No es exigible el etiquetado de los productos que incluyan materiales que contengan
OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM en proporción no
superior al 0,9% de los ingredientes alimenticios individualmente considerados,
siempre que esta presencia sea accidental o técnicamente inevitable.
Todos los ingredientes (harina, sémola, aceite, etc.) derivados de una misma
especie (p. ej., maíz, soja, colza, etc.) se consideran colectivamente un solo
ingrediente (p. ej., maíz).
Figura 1. No se exige etiquetado. La cantidad tanto de soja GM como de maíz GM
está por debajo del umbral legal.
Si, por ejemplo, un ingrediente derivado exclusivamente del maíz contiene menos de
un 0,9 % de maíz GM, no es necesario etiquetar el alimento obtenido a partir de él.
Por el contrario, si contiene más de un 0,9 % de maíz GM, es obligado etiquetar los
Maíz no GM99,4%
Maíz GM0,6%
Soja no GM 99,4%
Soja GM0,6%
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 4
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
productos alimenticios derivados. Esto es así incluso si en el producto final,
considerando la suma de todos los ingredientes derivados de especies distintas (p.
ej., soja y maíz), la cantidad relativa de maíz GM desciende por debajo del 0,9 %. Si
están presentes dos o más variedades distintas de maíz GM, habrá que sumar sus
concentraciones y utilizar el porcentaje total para determinar si es necesario o no
etiquetar (figura 2). Si la suma resultante está por debajo del umbral del 0,9 %, no
será obligado etiquetar.
Figura 2. Es necesario etiquetar en razón del ingrediente maíz. La suma de las
modificaciones Bt-11 (0,6 %) y Bt-176 (0,6 %) rebasa el umbral del 0,9 % exigido
para el etiquetado.
El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de
secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de
la planta (p. ej., el de la lectina en el caso de la soja y los de la invertasa o la zeína
en el del maíz). El porcentaje de OGM resultante se expresa, por lo tanto, así: OGM
(%)= ADN-GM/ADN-referencia x 100.
Métodos de cuantificación basados en la PCR
Un grave inconveniente de la PCR convencional es la ausencia de información
cuantitativa exacta debido a la eficiencia de la amplificación. Si la eficiencia de la
Maíz no GM98,8%
Maíz Bt 176 0,6%
Soja no GM 100%
Maíz Bt 11 0,6%
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 5
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
reacción permaneciera constante para cada ciclo de amplificación, la concentración
de ADN posterior a la PCR sería directamente proporcional a la cantidad de ADN
diana inicial. Lamentablemente, la eficiencia de la amplificación varía de una
reacción a otra, así como en ciclos sucesivos de una misma reacción. En particular,
en los últimos ciclos de la PCR los productos de la amplificación se forman de
manera no exponencial y a una velocidad de reacción desconocida.
La cuantificación del ADN basada en la PCR convencional se apoya en la medición
en el punto final, a fin de conseguir la sensibilidad máxima, cuando la amplificación
alcanza el rendimiento máximo (la denominada «fase meseta»). En esta etapa la
reacción ha superado la fase exponencial, a causa fundamentalmente del
agotamiento de los reactivos y de la inactivación térmica gradual de la polimerasa
utilizada. Por ello, la correlación resultante entre la concentración del producto final y
el número de moléculas diana iniciales es limitada.
Para superar este problema se han desarrollado técnicas como la PCR competitiva
cuantitativa (PCR-CC) y la PCR en tiempo real, que se proponen establecer una
relación entre la concentración de ADN diana y la cantidad de producto de la PCR
generada por la amplificación.
PCR competitiva cuantitativa
Uno de los primeros métodos de PCR cuantitativa desarrollados es la PCR
competitiva cuantitativa (Giacca et al., 1994; Studer et al., 1998; Hardegger et al.,
1999). Este método se basa en la coamplificación de la plantilla de ADN diana y
cantidades definidas de un patrón de ADN interno (competidor) que portan los
mismos sitios de unión del cebador. Dado que se conoce la cantidad de competidor
inicial y que la eficiencia de la amplificación es la misma en los ADN competidor y
diana, la proporción de las cantidades de los dos productos de la PCR, determinada
por ejemplo mediante electroforesis en gel, es representativa de la proporción de los
ADN diana y competidor presentes en la mezcla de reacción antes de la
amplificación.
Normalmente un competidor es un plásmido linearizado que lleva la misma
secuencia de nucleótidos que el ADN diana, salvo una supresión o inserción que
permite, una vez coamplificado, obtener dos bandas de distinto tamaño tras una
electroforesis de geles estándar.
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 6
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
ADN amplificado de la diana
ADN amplificado del competidor
Figura 3. Coamplificación de una cantidad fija de ADN diana con distintas
cantidades de ADN competidor.
La PCR competitiva se ha utilizado con éxito para cuantificar tanto el ADN como en
ARN, pero su intervalo dinámico se limita a una proporción diana/competidor
comprendida entre aproximadamente 1:10 y 10:1. De hecho, la máxima exactitud se
obtiene encontrando el punto de equivalencia en el que la proporción
diana/competidor es 1:1 (figura 3). Para conseguir una proporción adecuada, habrá
que ensayar varias diluciones.
Otro inconveniente de este método es la necesidad de construir y caracterizar un
competidor diferente para cada diana que se vaya a cuantificar. En realidad, incluso
diferencias pequeñas en la eficiencia de la amplificación pueden comprometer
gravemente la exactitud de la cuantificación mediante la PCR competitiva
cuantitativa. Por último, al final de la reacción, la PCR competitiva exige una
cuantificación adecuada de los amplicones de la diana y del competidor, lo que suele
exigir un laborioso tratamiento ulterior.
La PCR competitiva es un método semicuantitativo que comporta la comparación de
un patrón (el competidor) con la muestra. Los resultados solo pueden indicar un
valor inferior, igual o superior a una concentración patrón definida.
No obstante, el sistema de la PCR competitiva tiene la ventaja de que los
laboratorios no necesitan adquirir equipos especializados, ya que puede aplicarse
con el instrumental habitual de un laboratorio de biología molecular y PCR.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real representa una metodología de la PCR más exacta y más
utilizada actualmente. Al contrario que en el caso de las determinaciones en el punto
final, los sistemas de PCR en tiempo real monitorizan la reacción a medida que tiene
lugar. En este tipo de sistema, la PCR se acopla a la emisión de una señal
fluorescente proporcional a la cantidad de producto de la PCR producido en ciclos
posteriores. Esta señal se intensifica proporcionalmente a la cantidad de producto de
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 7
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
la PCR generado en cada ciclo de reacción sucesivo. Registrando la cantidad de
emisión fluorescente en cada ciclo, es posible monitorizar la PCR durante su fase
exponencial. El primer incremento significativo de la fluorescencia se correlaciona
con la cantidad inicial de plantilla diana (Ahmed, 2002).
Historia de las técnicas de PCR en tiempo real
Higuchi et al. (1992,1993) fueron los pioneros del análisis de la cinética de la PCR al
diseñar un sistema capaz de detectar los productos de la PCR a medida que se
acumulan. Este sistema «de tiempo real» incluía la molécula intercalante de bromuro
de etidio en cada mezcla de reacción. Para llevar a cabo las rondas se utilizaba un
termociclador adaptado para irradiar las muestras con luz ultravioleta y capaz de
detectar la fluorescencia resultante con una cámara CCD (dispositivo de
acoplamiento de cargas) controlada por ordenador y refrigerada. A medida que
´tenía lugar la amplificación, se producían cantidades crecientes de ADN bicatenario,
con bromuro de etidio intercalado, que inducían un aumento de la fluorescencia. Al
representar gráficamente la emisión de luz fluorescente frente al número de ciclo, el
sistema producía gráficos de la amplificación que daban una imagen más completa
del proceso de la PCR que el estudio de la acumulación del producto tras un número
de ciclos fijo.
Principios de la PCR en tiempo real
La especificidad del método de la PCR en tiempo real depende de las sustancias
utilizadas para generar y monitorizar la reacción de amplificación y del instrumento
utilizado para monitorizar la señal. Se han desarrollado varias sustancias al efecto:
colorantes de intercalación (bromuro de etidio, SYBR Green I) y sondas de
hibridación (sondas TaqMan, sondas FRET, balizas moleculares, Scorpions y
sondas TaqMan Minor Groove Binder).
PCR en tiempo real con uso del colorante SYBR Green I
La primera aplicación de la PCR en tiempo real derivó directamente de los
experimentos de Higuchi et al. (1992, 1993), sin más que sustituir el bromuro de
etidio por un agente intercalante del ADN bicatenario, fluorescente, menos tóxico y
más específico y sensible (entre 10 y 25 veces), el SYBR Green I (Haugland, 2002).
El colorante SYBR Green I se une al surco menor del ADN bicatenario, pero no al
ADN monocatenario. A consecuencia de esta unión, se potencia enormemente
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 8
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
(entre 800 y 1 000 veces) la fluorescencia (excitación aprox. a 488 nm y 254 nm;
emisión aprox. a 560 nm). Al iniciarse la PCR, el aumento de la cantidad de ADN
recién sintetizado produce un incremento de la señal fluorescente (Figura 4). No
obstante, el sistema de detección de secuencias basado en el SYBR Green I
presenta una limitación, que es la falta de especificidad de su modo de
reconocimiento del ADN. Por este motivo, se cuantifican todas las moléculas de ADN
bicatenario presentes en una PCR, incluidos los productos de la PCR no específicos
y los dímeros de los cebadores. Para resolver este problema y sustraer el
componente de la cuantificación debido a los ADN no específicos y a los dímeros de
cebadores en algunos dispositivos, es posible realizar un análisis de la curva de
fusión. Tras la fase final de la PCR, los productos se funden lentamente y se recogen
los datos de fluorescencia. Toda vez que cada ADN bicatenario tiene una
temperatura de fusión específica, es posible cuantificar los componentes que tienen
temperaturas de fusión diferentes en una única mezcla de reacción, eliminando así
de la cuantificación los componentes no específicos.
Métodos de la PCR en tiempo real basados en sondas específicas para una secuencia
El problema de la especificidad de la detección por fluorescencia del amplicón se ha
resuelto utilizando sondas específicas para una secuencia con un marcado
fluorescente diseñado en el interior del par de cebadores de la PCR. El proceso de
hibridación (y degradación final) de la sonda no suele interferir con la acumulación
exponencial del producto de la PCR. Se utilizan ahora unos pocos principios
diferentes para conseguir reacciones de cuantificación basadas en la PCR en tiempo
real específicas.
Sondas FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) La FRET se basa en la transferencia de energía de un fluoróforo donador a un
fluoróforo aceptor (figura 4) (Haugland, 2002). Las condiciones básicas de la FRET
son:
• Las moléculas del donador y del aceptor deben estar muy próximas (habitualmente
10–100 Å).
• El espectro de absorción del aceptor debe solaparse con el espectro de emisión de
fluorescencia del donador.
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 9
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
• Las orientaciones de los dipolos de transición del donador y el aceptor deben ser
aproximadamente paralelas.
Si los fluoróforos donador y aceptor están muy próximos, la excitación del donador
por la luz azul desencadena una transferencia de energía al aceptor, que entonces
puede emitir luz de una longitud de onda mayor. La formación de productos de la
PCR puede monitorizase utilizando dos sondas de oligonucleótidos con
específicidad de secuencia con una marca fluorescente, denominadas sondas de
hibridación, además de los cebadores de la PCR. Las sondas de hibridación se
diseñan como pares en los que una sonda se marca con el colorante donador (3’-
fluorescina) y la otra con el aceptor (5’- Red 640 o 5’-Red 705). Dado que la FRET
disminuye con la sexta potencia de la distancia, es necesario diseñar las sondas de
hibridación de manera que se hibriden a regiones adyacentes de la plantilla de ADN
(usualmente están separadas por una distancia de 1-5 nucleótidos). Si se hibridan
ambas sondas, los dos colorantes se aproximan mucho y la FRET al colorante
aceptor produce una señal mensurable mediante fluorometría.
Sondas de degradación (principio TaqMan) El ensayo TaqMan aprovecha la actividad exonucleásica 5' - 3' de la ADN
polimerasa Taq para dividir una sonda de degradación durante la PCR (Lie y
Petropoulos, 1998). La sonda de degradación, o TaqMan, suele ser un
oligonucleótido de 20-30 bases de longitud (usualmente con una Tf 10 °C superior a
la Tf de los cebadores) que contiene un colorante delator fluorescente en el extremo
5' y un colorante inhibidor en el 3' (figura 4). Al estar bloqueado el extremo 3', la
sonda no puede extenderse como un cebador. Durante la PCR, en presencia de una
diana, la sonda se hibrida específicamente entre los sitios de los cebadores directo e
inverso. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante delator al
colorante inhibidor produce la supresión de la fluorescencia delatora principalmente
por transferencia de energía de tipo Forster (Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Durante
la reacción, la actividad exonucleásica 5’-3’ de la ADN polimerasa Taq degrada la
sonda entre los colorantes delator e inhibidor solamente si la sonda se hibrida con la
diana. De esta manera, la fluorescencia aumenta a medida que progresa la
amplificación. La acumulación de producto de la PCR se detecta monitorizando el
incremento de la fluorescencia del colorante delator. Este proceso tiene lugar en
cada ciclo y no interfiere con la acumulación exponencial del producto. Las sondas
de degradación, a diferencia de las FRET, liberan fluorocromos en cada ciclo,
añadiendo más colorante al previamente liberado. En consecuencia, la señal
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 10
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
fluorescente se potencia considerablemente en cada ciclo. El ensayo TaqMan utiliza
unos parámetros de los ciclos térmicos y unas condiciones de la PCR que son
universales. Las sondas fluorogénicas exigen, eso sí, que no haya G en el extremo
5'. Una G adyacente al colorante delator inhibe la fluorescencia incluso tras la
división.
Figura 4.Diferentes
principios de la
PCR en tiempo real.
I. SYBR green I.
II. Sondas FRET
(transferencia de energía de
resonancia
fluorescente).
III. Sondas de
degradación TaqMan 5`
III. Sondas TaqMan
II. Sondas de hibridación
I. SYBR Green
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 11
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
Balizas moleculares Las balizas moleculares son sondas de ADN diseñadas para contener una estructura
en forma de piruleta. La secuencia del abultamiento de la piruleta es complementaria
de la diana específica de la sonda y las secuencias del estrechamiento se diseñan
de manera que sean mutuamente complementarias (figura 5) (Tyagi y Kramer,
1996). Los extremos 5’ y 3’ de la sonda se unen covalentemente a un fluoróforo y a
un inhibidor. Cuando se cierra la estructura de piruleta, el fluoróforo y el inhibidor se
aproximan. En este caso, todos los fotones emitidos por el fluoróforo son absorbidos
por el inhibidor. En presencia de una secuencia complementaria, la sonda se
despliega y se hibrida con la diana. El fluoróforo se ve desplazado del inhibidor y la
sonda inicia su fluorescencia.
Figura 5. Principio de las balizas moleculares.
Scorpions Otra posibilidad es la que ofrece la familia de sondas denominadas Scorpions. Un
Scorpion consiste en una secuencia de sonda específica con estructura de piruleta
(figura 6) (Thelwell et al., 2000). Se une un fluoróforo al extremo 5' y la señal fluorescente que da es inhibida en la
estructura de piruleta por una fracción unida al extremo 3'. La piruleta se une al
extremo 5' de un cebador. Tras la extensión del cebador del Scorpion, durante la
amplificación, la secuencia de sonda específica puede unirse a su complemento
dentro de la misma hebra de ADN. Esta hibridación abre el abultamiento de la
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 12
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
piruleta de manera que deja de inhibirse la fluorescencia y puede observarse un
incremento de la señal. Un bloqueante de la PCR situado entre el cebador y la
secuencia del estrechamiento evita que pase a leerse el abultamiento de la piruleta,
lo que podría ocasionar su apertura en ausencia de la secuencia diana específica. El
carácter unimolecular de la hibridación presenta ciertas ventajas con respecto a los
sistemas de sonda homogénea. A diferencia de los ensayos con balizas
moleculares, TaqMan o FRET, los ensayos con Scorpion no requieren una sonda
independiente aparte de los cebadores.
Figura 6. Principio de las sondas Scorpion.
Sondas TaqMan MGB Un MGB (enlazante al surco menor) es una pequeña molécula en forma de media
luna que encaja muy bien en el surco menor del ADN bicatenario (Kutyavin et al.,
2000). En las sondas TaqMan, el grupo MGB está unido al extremo 3' junto con el
colorante inhibidor (figura 7). Cuando la sonda TaqMan se hibrida, el MGB estabiliza
el apareamiento incorporándose al surco menor del ADN bicatenario creado entre la
sonda y la secuencia diana. La estabilización es mucho más eficaz cuando las
Cebador
Extensión
Hibridación
Desnaturalización
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 13
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
secuencias coinciden perfectamente (es decir, no hay desparejamiento). Además del
superior potencial discriminador, la mayor estabilidad hace que las sondas TaqMan
MGB sean muy cortas (normalmente de 13 a 20 bases) en comparación con las
sondas TaqMan estándar (de 18 a 40 bases), sin detrimento del respeto de las
directrices de diseño. Las sondas TaqMan MGB presentan varias ventajas para la
PCR cuantitativa, especialmente para los ensayos Múltiples. El mejor rendimiento
espectral hace posible una precisión y una coherencia superiores entre los distintos
ensayos, y la mayor especificidad de la hibridación permite una discriminación más
precisa de las dianas. Además, al ser la sonda más pequeña se facilita el diseño de
ensayos, pues las sondas se pueden encajar en regiones diana más cortas, tales
como «ventanas» de consenso entre conservación o divergencia de la secuencia. El
tamaño del amplicón puede reducirse al mínimo utilizando sondas MGB más cortas
que pueden contribuir a mejorar la coherencia entre ensayos.
Figura 7. Principio de las sondas MGB.
Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real
Cuantificación relativa El contenido en OGM de una muestra puede expresarse como la cantidad de
material modificado genéticamente en la cantidad total de material. Para determinar
este valor en un sistema basado en la PCR en tiempo real es necesario medir el
número de secuencias de ADN de un gen de referencia endógeno (para usarlo como
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 14
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
«normalizador»), así como el número de secuencias de ADN diana específicas del
OGM. El gen de referencia debe escogerse de manera que sea específico de la
especie, presente en una sola copia por genoma haploide, representado como tal de
manera estable en líneas diferentes de la misma especie y tan amplificable como los
caracteres GM en el análisis (aunque esto se deba más a un buen diseño de
cebadores-sonda). En la cuantificación relativa se plantea un problema debido a la
interpretación del porcentaje de contenido de OGM, que no se especifica en la
legislación; por consiguiente, puede entenderse como contenido en OGM (en
porcentaje) el peso del ingrediente modificado puro en relación con el peso total del
ingrediente puro (p. ej., peso de maíz GM con respecto al peso total del maíz
contenido en la muestra). Desde un punto de vista analítico, es conveniente calcular
el porcentaje de OGM como el número de secuencias de ADN diana por secuencia
específica de taxón diana, pero esta definición no incorpora algunas características
importantes de las líneas de OGM; por este motivo, es preciso sopesar
cuidadosamente los siguientes parámetros en la interpretación de los resultados:
a) La ploidía de la transformación. Es posible que la modificación genética tenga una
ploidía diferente de la de la transformación wt (p. ej., tetraploide en vez de diploide).
b) La cigosidad del evento. El carácter GM podría ser homocigótico o heterocigótico.
c) El número de inserciones por genoma haploide de una única construcción
genética artificial. Un construcción genética se puede insertar en una única copia por
genoma haploide o en varias copias.
El punto c) puede obviarse diseñando el sistema cebador-sonda en la frontera de la
inserción de la construcción genética en el genoma. Como las secuencias de
frontera son únicas, el sistema así construido presentará la doble ventaja de ser
específico de la transformación y excluir de la cuantificación las inserciones múltiples
de la misma construcción genética. Los puntos a) y b) se resuelven empíricamente
utilizando materiales de referencia que sean homogéneos con la muestra (p. ej.,
material de referencia de harina de maíz para cuantificar la harina de maíz).
Alternativamente, pueden calibrarse patrones de cuantificación diferentes de los
materiales de referencia certificados (p. ej., secuencias de ADN clonadas o mezclas
de ADN genómico) utilizando materiales de referencia certificados a fin de corregir
las discrepancias moleculares en la cuantificación. Una manera ampliamente
aceptada de solventar los problemas relacionados con los puntos a) y b) es expresar
el porcentaje de OGM en términos de genomas haploides.
En cualquier caso, es preciso tener en cuenta este aspecto de la cuantificación al
desarrollar el método, dado que el límite de detección (LOD) y el límite de
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 15
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
cuantificación (LOQ) se ven influidos por el número real de copias que se
cuantifican.
Diseño de un experimento de cuantificación de OGM en tiempo real El diseño de un análisis de la PCR en tiempo real debe incluir los siguientes
componentes:
- Un sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de ADN diana
específica de un OGM.
- Un segundo sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de referencia
endógena, posiblemente específica de la especie, pero que se pueda utilizar como
«normalizador» en los cálculos de la concentración o las concentraciones relativas
de OGM.
- Curvas patrón para la diana y la referencia endógena. Para cada muestra
experimental, se determina la cantidad de diana y de referencia endógena a partir de
la curva patrón adecuada. La cantidad de diana se normaliza con la cantidad de
referencia endógena para obtener la concentración relativa de la diana. Para
satisfacer los requisitos estadísticos, las curvas patrón deben incluir por lo menos 4
puntos de concentración distintos. Cada punto de la curva patrón, así como la
muestra, debe cargarse al menos por triplicado.
Además, habrá que añadir un control negativo (NTC o control sin ADN molde) tanto
respecto al gen de referencia como a las cuantificaciones de OGM. Pueden utilizarse
también otros controles (p. ej., control negativo de la diana de ADN y control positivo
de la diana de ADN).
Por último, la cuantificación del gen de referencia y de la secuencia específica del
OGM debe tener lugar en el mismo ciclo de PCR (coamplificación), no en ciclos
diferentes, para evitar una posible fluctuación estadística entre experimentos
distintos.
PCR en tiempo real Múltiplex Dependiendo de las sustancias y del instrumental utilizados en la cuantificación, es
posible diseñar PCR en tiempo real para llevar a cabo la cuantificación de las
secuencias de referencia y OGM por separado en tubos distintos o en los mismos
tubos en tanto que reacción «Múltiplex».
Ambas posibilidades tienen sus ventajas y sus inconvenientes. Con las reacciones
múltiples se ahorran tiempo y reactivos (es posible analizar el doble de muestras en
un único experimento) y se evitan los errores de configuración entre la medida del
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 16
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
gen de referencia y del gen diana del OGM, al producirse en el mismo tubo, pero
resultan menos sensibles (en términos de LOQ) a causa de la interferencia entre las
dos reacciones y del distinto consumo de reactivos en ambas. El uso de reacciones
separadas para medir el gen de referencia y el gen diana del OGM, por su parte,
permite obtener mayor sensibilidad en términos de LOQ, pero exige disponer del
doble de reactivos y de pocillos en el equipo de PCR en tiempo real, y es mayor el
riesgo que suponen, p. ej., los errores de pipeteado, al medir una muestra. La
disponibilidad de múltiples colorantes delatores para las sondas TaqMan permite
detectar la amplificación de más de una diana en el mismo tubo. El colorante delator
(FAM) puede distinguirse del otro (VIC) gracias a las diferentes longitudes de onda
de sus máximos de emisión. Así por ejemplo, la disponibilidad de múltiples
colorantes con distintas longitudes de onda de emisión (FAM, TET, VIC y JOE)
permite realizar ensayos TaqMan Múltiplex. El colorante TAMRA se usa como
inhibidor en la sonda y el ROX como referencia pasiva en la mezcla de reacción. Se
recomienda la combinación de FAM (diana) y VIC (control endógeno) para obtener
los mejores resultados, ya que la diferencia entre sus máximos de emisión es la más
amplia. Por el contrario, JOE y VIC nunca deben combinarse. La realización de
ensayos TaqMan Múltiplex en los sistemas de detección de secuencias ABI PRISM
7700, 7900, 7500, 7300 y 7000 es posible gracias a su capacidad para detectar
colorantes múltiples con longitudes de onda de emisión distintas.
Análisis gráfico de los datos de una PCR en tiempo real A medida que progresa la PCR, se recogen datos sobre fluorescencia (valores Rn)
para construir un gráfico de la cantidad de señal frente al número de ciclo (es decir,
el tiempo). Habitualmente el gráfico se construye a escala semilogarítmica. En la
PCR en tiempo real es posible distinguir tres fases distintas: una primera fase de
«latencia» con ligeras fluctuaciones en los valores correspondientes a la señal de
fondo; una segunda fase exponencial, con valores que se incrementan en paralelo, y
una tercera fase en la que los valores tienden a situarse en una «meseta» (figura 8).
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 17
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
Figura 8. Gráfico de la PCR en tiempo real. Se señalan las fases típicas de una PCR
en tiempo real.
Si la PCR en tiempo real constituye una herramienta potente, esto se debe a que la
cuantificación no se produce en la fase final de la reacción (la meseta), sino en la
fase en que el crecimiento exponencial de la cantidad de ADN amplificado (Rn)
alcanza un valor significativamente superior a la señal de fondo. Al medir de esta
manera, mejora considerablemente la exactitud de la cuantificación, ya que existe
una correlación directa entre la cantidad de plantilla inicial y la fase en la que la
amplificación empieza a ser exponencial. En la PCR en tiempo real, se define
experimentalmente como ciclo umbral (CT) aquel ciclo en que la señal de
fluorescencia alcanza el valor medio de las señales de fluorescencia medidas entre
el ciclo tercero y el decimoquinto incrementado en diez desviaciones estándar.
Cuanto mayor es la cantidad inicial de ADN genómico, antes se detecta el producto
acumulado en el proceso de la PCR, y más bajo es el valor CT. En la práctica, a
menudo es el operador el que elige la línea umbral que determina el valor CT, lo que
constituye uno de los elementos subjetivos de la PCR en tiempo real. La línea
umbral debe situarse por encima de cualquier actividad basal y dentro de la fase de
crecimiento exponencial, que adquiere forma lineal en la transformación logarítmica
(todas las líneas son paralelas). Debe situarse siempre en el nivel en que empiezan
a coincidir más los gráficos de las réplicas. A veces las réplicas presentan, al
Fase exponencial
Valor umbral
Fluorescencia de fondo
Intervalo «meseta»
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 18
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
comienzo de la fase exponencial, una ligera divergencia que se atenúa o desaparece
según progresa la reacción.
Cálculo del contenido en OGM El resultado de una PCR en tiempo real es un valor ∆Rn, diferencia entre Rn+ (señal
de fluorescencia que incluye todos los componentes) y Rn- (señal de fondo de la
reacción – línea de base de la lectura de una muestra de control sin plantilla). El contenido de OGM de una muestra se puede determinar de dos maneras:
1. Se trazan dos curvas patrón, basadas en cantidades distintas de ADN:
- la primera con un sistema de cuantificación específico para el gen de referencia;
- la segunda con un sistema de cuantificación específico para la diana GM.
Para cada muestra, se determinan mediante interpolación con la curva patrón las
cantidades correspondientes a la diana específica y al gen de referencia. Luego se
calcula el contenido (porcentaje) de ADN GM como el cociente entre la cantidad de
la secuencia diana GM y la cantidad de la secuencia del gen de referencia
(GM/referencia * 100). Conviene tener presente que, necesariamente, las muestras analizadas deben estar
situadas entre los límites inferior y superior de ambas curvas patrón. Es preciso
excluir los valores atípicos, ya que suelen relacionarse con errores de cuantificación. 2. Método de comparación de CT (∆∆CT): En este método no se usan cantidades
conocidas de patrones, sino que se compara la cantidad relativa de la secuencia
diana del OGM con la secuencia del gen de referencia. La curva patrón se obtiene
cargando una serie de muestras con concentraciones diferentes y conocidas del
OGM (p. ej., materiales de referencia certificados del IRMM). El resultado es una
curva patrón de valores ∆∆CT (∆CT = CT gen de referencia - CT OGM). El contenido de OGM
se obtiene calculando el valor ∆CT de la muestra y comparándolo con los valores
obtenidos con los patrones. Para que este método dé buenos resultados, es preciso que las eficiencias de
amplificación de los sistemas de PCR diana y de referencia sean similares. Una
manera sensible de controlarlo es fijarse en cómo varía ∆CT (la diferencia entre los
dos valores CT de dos PCR correspondientes a la misma cantidad inicial de plantilla)
con la dilución de la plantilla. Si las eficiencias de los dos amplicones son
aproximadamente iguales, la representación gráfica del logaritmo de la cantidad
frente a ∆CT será una línea casi horizontal (pendiente <0,10). Esto significa que
ambas PCR tienen la misma eficiencia en el intervalo de cantidades de plantilla
iniciales. Si el gráfico pone de manifiesto que la eficiencia es desigual, deberá
aplicarse el método de la curva patrón para cuantificar los OGM. Debe determinarse
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 19
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
el intervalo dinámico para: 1) las concentraciones mínima y máxima de las dianas
para las que los resultados son exactos y 2) las razones mínima y máxima de dos
cantidades de gen para las que los resultados son exactos. En la PCR en tiempo
real competitiva convencional, el intervalo dinámico se limita a una proporción
diana/competidor de aproximadamente 10:1 a 1:10 (la máxima exactitud se obtiene
para una proporción 1:1). La PCR en tiempo real puede conseguir un intervalo
dinámico mucho más amplio.
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 20
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
Bibliografía
Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de
septiembre de 2003, sobre alimentos y piensos modificados genéticamente, DO L
268 de 18.10.2003, pp. 1-23.
Reglamento (CE) n° 1830/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de
septiembre de 2003, relativo a la trazabilidad y al etiquetado de organismos
genéticamente modificados y a la trazabilidad de los alimentos y piensos producidos
a partir de éstos, y por el que se modifica la Directiva 2001/18/CE, DO L 268 de
18.10.2003, pp. 24-28.
Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified organisms in foods.
Trends in Biotechnology 5, 215-23.
Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann
Phys (Leipzig) 2, 55-75.
Giacca, M., Zentilin, L., Norio, P., Diviacco, S., Dimitrova, D., Contreas, G., Biamonti,
G., Perini, G., Weighardt, F., Riva, S. y Falaschi, A. (1994). Fine mapping of a
replication origin of human DNA. Proceedings of the National Academy of Science
USA 91, 7119-23.
Hardegger, M., Brodmann, P. y Hermann, A. (1999). Quantitative detection of the
35S promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR. European
Food Research Technology 209, 83–87.
Haugland, R.P. (2002). The Handbook of Fluorescent Probes and Research
Products, Ninth Edition. Molecular Probes, Inc.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-
Handbook.html (Último acceso enero de 2010)
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. y Griffith, R. (1992). Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10, 413–417.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. y Watson, R. (1993). Kinetic PCR: Real-time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, 1026–1030.
PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 21
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10
Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S.,
Singer, M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W.,
Meyer, R.B. y Hedgpeth, J. (2000). 3'-minor groove binder-DNA probes increase
sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Research 28,
655-61.
Lakowicz, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New
York, chapter 2.
Lie, Y. S. y Petropoulos, C. J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5'
nuclease assays. Current Opinion Biotechnol 9, 43-48.
Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, J. y Hübner, P. (1998). Quantitative competitive PCR
for the detection of genetically modified soybean and maize. Zeitschrift für
Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, 207–213.
Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. y Brown, T. (2000). Mode of action
and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Research
28, 3752-3761.
Tyagi, S. y Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon
hybridisation. Nature Biotechnology 14, 303-308.
Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. y Brignon, P. (1999). Real-time
quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup
Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food Chemistry
47, 5261–5266.