Post on 25-Sep-2018
UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
TESIS DOCTORAL
ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS DE LTC4S, ALOX5 Y ALOX5AP EN POBLACIÓN ASMÁTICA DE GRAN
CANARIA
JOSÉ ÁNGEL CUMPLIDO BONNY
SERVICIO DE ALERGOLOGÍA HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA
DOCTOR NEGRÍN
2015
A mi madre No elegimos la familia en la que nacemos y crecemos. Que buena suerte he tenido.
A mi mujer
Su alegría ante la vida es un estímulo constante.
AGRADECIMIENTOS
A mi Directora de tesis, Doctora Teresa Carrillo, por su inestimable ayuda,
apoyo y asesoramiento. Su sutil y educado apremio ha sido fundamental en la recta final.
Su constancia y capacidad de trabajo, un ejemplo a seguir.
A mi Director de tesis, Carlos Blanco, por su disponibilidad y ayuda constantes a
pesar de la distancia.
A María José Torres y su equipo en la unidad de investigación, gracias por el
minucioso trabajo realizado en la extracción y análisis del ADN.
A Estefanía Herrera y Luis Alberto Henríquez, por aclarar pacientemente mis
dudas sobre genética y estadística.
A mis compañeros del servicio de alergia: auxiliares, administrativos, médicos y
enfermeras. Todos son parte de esta Tesis, sin su colaboración no habría sido posible.
INDICE
Pág.
Lista de abreviaturas.......................................................................I
1. INTRODUCCION………………………………………………………….…...…1
1.1. Epidemiología……………….…………………………………………...2
1.2. Historia natural…….…………………………………………….……..6
1.3. Conceptos: Gravedad, control y exacerbaciones. ……..……6
1.3.1. Gravedad……………………………………………………………………….…..7
1.3.2. Control del asma..……………………………………………………….…….7
1.3.3. Exacerbaciones………………………………………………………………....8
1.4. Estudios de asociación genética y asma………………………..9
1.4.1. Características…………………………………………………………………..10
1.4.2. Estudios de asociación de gen candidato………………..……..11
1.4.3. Estudios de todo el genoma…………………………………………...12
1.4.3.1. Estudios de ligamiento de todo el genoma..……………..12
1.4.3.2. Estudios de asociación de todo el genoma (GWAS).…13
1.4.4. Estudios de resecuenciación……………………………………………..14
1.5. Genes asociados con asma……………...…………………………15
1.5.1. Dipeptidil peptidasa X (DDP10)……………………………………....16
1.5.2. Disintegrina A y metaloproteinasa 33 (ADAM33)………….…17
1.5.3. Receptor acoplado a proteína G (GPRA)……………………….….17
1.5.4. Protocadherina 1 (PCDH1)…………………………………………………17
1.5.5. Gen de filagrina………………………………………………………………….18
1.5.6. Gen de ORMDL3 (Tipo orosomucoide 3)…………………………..18
1.5.7. Gen del receptor adrenérgico β-2…………………………………..…18
1.5.8. Gen del receptor de interleucina 4 (IL4R)………………….…….19
1.5.9. Genes asociados con asma mediante GWAS………………….…19
1.6. Leucotrienos…………….……………………………………………….21
1.6.1. Leucotrienos y su implicación en el asma…………………………25
1.7. Patología respiratoria exacerbada por aspirina
(AERD: Aspirin exacerbated respiratory disease)…….26
1.8. Genes de la vía de síntesis de leucotrienos.
Vía de la 5-Lipoxigenasa (5-LO)…………………………..29
1.8.1. Asociación genética y asma…………………………………….……..…32
1.8.1.1. ALOX5………………………………………………………………………..….32
1.8.1.2. ALOX5AP…………………………………………………………………….…33
1.8.1.3. LTC4S………………………………………………………………………..….34
2. HIPOTESIS DE TRABAJO…………………………………………………..…36
3. OBJETIVO………………………………………………………………………….37
3.1. Objetivo primario………………………………………………………37
3.2. Objetivo secundario…………………………………………….…….37
4. MATERIAL Y METODOS……………………………………………….………38
4.1. Estudio de casos y controles. Diseño……………………………38
4.2. Datos Clínicos y analíticos…………………..……………………..39
4.2.1. Asma……………………………………………………………………………..……39
4.2.2. Atopia……………………………………………………………………………...…41
4.2.3. Pruebas de función respiratoria……………………………..………..42
4.2.4. Tolerancia a AINEs……………………………………………………………43
4.2.5. Resumen……………………………………………………………………………43
4.3. Determinaciones genéticas……………………………………..…44
4.3.1. Extracción del ADN genómico……………………………………….…44
4.3.2. Tipaje del polimorfismo LTC4S -444 A/C…………………………44
4.3.3. Tipaje de los polimorfismos ALOX5 -176/-147 y
ALOX5AP -169/-146……………………………………….………………………...45
4.3.4. Confirmación de secuencias …………………………………………….46
4.4. Análisis estadístico………………………………….……………….47
5. RESULTADOS………………………………………………………………..….48
5.1. Datos poblacionales……………………………………………….…48
5.2. Polimorfismos de la vía de la 5-LO…………………….……..…56
5.2.1. Análisis de genotipos…………………………………………………….....57
5.2.1.1. LTC4S……………………………………………………………………..…...58
5.2.1.2. ALOX5…………………………………………………………………….….…61
5.2.1.3. ALOX5AP………………………………………………………………………64
5.2.1.4. Análisis conjunto de los polimorfismos………….…….…….68
5.3. Intolerancia a AINEs – gravedad del asma……………..……69
6. DISCUSION……………………………………………………………….……..71
7. CONCLUSIONES…………………………………………………………..…….91
8. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………….…….92
9. ANEXO I………………………………………………………………..…117
9.1. Publicaciones con aportación de los datos presentados
I
Abreviaturas
AAS Acido acetil salicílico.
Ad Modelo de herencia Aditivo.
ADAM33 Disintegrina A y metaloproteinasa 33.
AERD Patología respiratoria exacerbada por aspirina.
AG Asma persistente grave.
AINEs Antiinflamatorios no esteroideos.
ALOX5 Gen de la 5-LO.
ALOX5AP Gen de la proteína activadora de la 5-LO (FLAP).
ANG Asma no persistente grave.
Anti-LT Anti Leucotrienos.
BLT1 Receptor uno del leucotrieno B.
BLT2 Receptor dos del leucotrieno B.
CNVs Variaciones en el número de copias en el genoma.
C Citosina.
Co Modelo de herencia Codominante.
COX-1 Cicloxigenasa-1.
CysLT Cisteinil-leucotrienos C4, D4, E4.
CysLTR1-R2 Receptor de cisteinil leucotrienos 1 y 2 respectivamente.
DDP10 Dipeptidil peptidasa X.
Do Modelo de herencia Dominante.
Dpt Dermatophagoides pteronyssinus.
EPOC Enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
ERS European Respiratory Society.
FeNO Oxido nítrico exhalado.
II
ESCASE Estudio del Control del Asma en España.
FEV1 Volumen de aire que se expulsa durante el primer segundo
de la espiración forzada.
FLAP Proteína activadora de la 5-lipoxigenasa.
FVC Capacidad Vital forzada.
G Guanina.
GAD Genetic Association Datebase.
GEMA Guía española para el manejo del asma.
GINA Global Iniciative for Asthma.
GPRA Receptor acoplado a proteína G.
GWAS Estudios de asociación de todo el genoma.
LT Leucotrienos.
LTA4 Leucotrieno A4.
LTA4H Leucotrieno A4 hidrolasa
LTB4 Leucotrieno B4.
LTB4R1-R2 Receptor del leucotrieno B4 1 y 2 respectivamente.
LTC4 Leucotrieno C4.
LTC4S Leucotrieno C4 sintasa.
LTD4 Leucotrieno D4.
LTE4 Leucotrieno E4.
MAF Frecuencia del alelo menor.
NHLBI Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre de
EEUU.
OMS La Organización Mundial de la Salud.
PCDH1 Protocadherina 1.
PGE2 Prostaglandina E2.
III
RFLP Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción.
(Restriction Fragment Length Polymorphism).
PGD2 Prostaglandina D2.
Re Modelo de herencia Recesivo.
RGE Reflujo gastroesofágico.
SNS Sistema Nacional de Salud.
SNP Polimorfismo de un solo nucleótido (Single Nucleotide
Polymorphism).
TSLP Estroma tímico linfoproliferativo.
5-LO 5-lipoxigenasa.
VNTR Polimorfismos en el número de repetición en tandem
(Variable Number Tandem Repetition).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
1
1. INTRODUCCION
El asma es un problema de salud mundial que afecta en la actualidad
a alrededor de 300 millones de personas de cualquier edad, sexo, grupo
étnico y país. Se caracteriza esta afección por una considerable
heterogeneidad, que viene determinada por interacciones genéticas y
ambientales, mecanismos fisiopatológicos, exposiciones ambientales,
comorbilidades, edad, gravedad de la enfermedad de base, accesibilidad a
los servicios sanitarios y cuidados recibidos, factores psicológicos, respuesta
al tratamiento y características de la enfermedad, incluidas las
exacerbaciones y la muerte, así como la cronicidad (1).
Las primeras referencias históricas sobre el asma aparecen en el
antiguo Egipto, en concreto en el Papiro de Georg, donde se describen
recetas para el tratamiento de esta afección. El término asma deriva del
griego “aazein” que significa jadear, exhalar con la boca abierta, respirar
fuerte. Hipócrates en el “Corpus Hippocraticum” utiliza ya la palabra "asma"
como término médico. Más tarde, Maimónides, médico del Sultán Saladino
en su "Tratado del Asma" describe de forma minuciosa los síntomas típicos
del asma. Ya en el siglo XVII Ramazzini, conocido como el padre de la
medicina laboral, describe un vínculo entre el asma y el polvo orgánico y
también reconoce al asma inducida por ejercicio.
A pesar de que Salter en 1859 realizó una descripción del asma como
una enfermedad que cursaba con obstrucción reversible al flujo aéreo,
todavía en la primera mitad del siglo XX se consideraba que se trataba de
una enfermedad psicosomática (2). A partir de los años 60 del pasado siglo
se describió el asma como una enfermedad obstructiva de la vía aérea que
cursaba con hiperrespuesta bronquial. Por fin en 1995 el Instituto Nacional
del Corazón, Pulmón y la Sangre de EEUU (NHLBI) definió al asma como
“una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias en la que
intervenían muchos tipos de células, especialmente mastocitos, eosinófilos y
linfocitos B”.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
2
Más recientemente, la “Guía española para el manejo del asma”
(GEMA 2009) (3) ha definido al asma como un síndrome que incluye
diversos fenotipos clínicos que comparten manifestaciones clínicas similares,
pero de etiologías probablemente diferentes. Ello condiciona la propuesta de
una definición precisa, y así, las habitualmente utilizadas son meramente
descriptivas de sus características clínicas y fisiopatológicas. Desde un
punto de vista pragmático se podría definir como una enfermedad
inflamatoria respiratoria crónica, en cuya patogenia intervienen diversas
células y mediadores de la inflamación, condicionada en parte por factores
genéticos y que cursa con una obstrucción variable del flujo aéreo, total o
parcialmente reversible, ya sea por la acción de medicamentos o
espontáneamente.
1.1 Epidemiología
El asma es una de las enfermedades respiratorias crónicas más
frecuentes en la edad adulta y, sin ningún género de duda, la más frecuente
en la infancia.
La prevalencia está aumentando en muchos países, pero aún no se
dispone de datos suficientes para determinar las causas probables de este
incremento. Se desconoce la prevalencia real del asma a nivel mundial,
posiblemente por la falta de especificidad de los síntomas relacionados con
la enfermedad y por no existir una definición universalmente aceptada
desde el punto de vista epidemiológico.
Como ya se ha mencionado, se estima que padecen asma más de
300 millones de personas en el mundo, con una amplia variación geográfica
y siendo más frecuente en mujeres y en niños. La cifra varía entre países,
siendo mayor en países industrializados.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
3
En Europa, la prevalencia de asma en niños de países mediterráneos
es del 8 al 13,5%, excepto en Grecia que es del 3,7%. En España, la
prevalencia del asma en niños y niñas de 6-7 años es del 10,7% y del
8,7%, y de 13-14 años, del 9,3% y del 9,2% respectivamente (4). En
población adulta española se acepta que alrededor del 5% padece asma (5).
En cuanto a la tasa de mortalidad por asma por 100.000 adultos en
Europa, va del 0,54 de Holanda al 8,7 de Portugal. En España, para todas
las edades, en 1960 era de 9,36 y, en 2005, de 2,22. En el grupo de edad
de 5 a 34 años, los valores de la tasa de mortalidad para ambos sexos
oscilan entre 0,1 y 0,4 con una gran variabilidad en su evolución a lo largo
de los años (6).
Otro dato que pone de relieve la importancia del asma desde el punto
de vista de la salud pública es que en Europa el 38% de los niños y el 16%
de los adultos han perdido días de colegio o de trabajo, respectivamente,
dato que es superior en nuestro país. A nivel mundial, el asma es, tras la
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la causa de mayor
número de días de absentismo laboral por enfermedad respiratoria. La
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que anualmente se
pierden 15 millones de años de vida ajustados por incapacidad por asma
(6).
Numerosos estudios han demostrado que el asma es una enfermedad
infra-diagnosticada e infra-tratada. En España se ha estimado que un 52%
de los casos no han sido diagnosticados y un 26% de los que presentan
síntomas frecuentes, no siguen ningún tipo de tratamiento regular (7).
Existe una clara relación entre asma y alergia, de hecho, la presencia
de atopia aumenta la probabilidad de asma entre 10 y 20 veces. No
obstante, muchos asmáticos no son atópicos y no todos los atópicos
desarrollan asma (solo un 25-30% de los niños sensibilizados padecen
asma), por lo que cabe pensar que deben existir otros factores
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
4
concomitantes, no identificados, que modulen la evolución de este subgrupo
(2).
Según datos de la OMS, durante el 2005 se produjeron 255.000
muertes por asma en todo el mundo. Los principales factores que
contribuyen a la morbilidad y mortalidad por esta enfermedad son el
diagnóstico insuficiente y el tratamiento inadecuado. En nuestro país entre
1980 y 1996 se produjo una reducción en la tasa estandarizada de
mortalidad por asma para todas las edades, pasando en los hombres de
37,8 muertes por millón a 10,1 mientras que para las mujeres la tasa pasó
de 19,5 a 13,2. Analizando los datos disponibles en población más joven,
curiosamente no se ha producido esta reducción (8).
La prevalencia del asma y la creciente morbimortalidad asociada,
generan un notable consumo de recursos sanitarios y representan una
importante carga económica para la sociedad. Tanto la elevada prevalencia
como el progresivo incremento en la incidencia de asma en los países
desarrollados han convertido a esta enfermedad en un grave problema no
solo sanitario, sino también económico. Así, se estima que cerca del 2% del
gasto sanitario total de los países desarrollados, está ocasionado por la
asistencia y tratamiento del asma. Además, se prevé que el impacto del
asma aumentará en los próximos años, como consecuencia del aumento de
la esperanza de vida de la población, el incremento de la prevalencia y la
aparición de nuevos medicamentos.
En cuanto a datos económicos, según el estudio AsmaCost, realizado
en 2007, el coste económico del paciente adulto asmático en España
ascendía en ese momento a 1.726 y a 1.533 euros, desde la perspectiva de
la sociedad y del Sistema Nacional de Salud (SNS), respectivamente. El
coste era superior en los pacientes mayores de 65 años (2.069 euros) y en
aquellos con asma de mayor gravedad (959, 1.598, 1.553 y 2.635 euros
para asma intermitente, persistente leve, moderada y grave,
respectivamente) (9). El coste medio anual por niño asmático en España en
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
5
2008 era de 1.490 euros, y oscilaba entre 403 euros para el asma más leve
y 5.380 euros para la forma más grave (10).
Se estima que alrededor del 70% del coste total del asma es
consecuencia de su mal control y manejo; por otra parte, los costes
indirectos y una parte de los directos, como gastos de hospitalización,
visitas a Urgencias o muerte, son los mayores responsables del consumo de
recursos económicos debido al asma (11). En el Estudio del Control del
Asma en España (ESCASE) se evaluó el control del asma en nuestro país
según las recomendaciones de la “Global Iniciative for Asthma” (GINA)
(12), los resultados fueron ciertamente desalentadores: más de las dos
terceras partes de los pacientes estudiados tenían un mal control del asma
(13). Estos datos, en su conjunto, sugieren que realizar un diagnóstico
preciso de asma, unido a un incremento de la utilización de fármacos
antiinflamatorios preventivos, a la mejora de la educación del paciente
asmático y al seguimiento estrecho de las recomendaciones de las
sociedades científicas, puede redundar en un mejor control de la
enfermedad y en una reducción de los costes asociados.
Se acepta que alrededor del 5% de los pacientes asmáticos padecen
asma grave no controlada y que estos consumen más del 50% de los
recursos sanitarios dedicados a esta enfermedad. Por otra parte, se ha
estimado que sólo en el 55% de los afectados con sospecha inicial de asma
grave no controlada se confirma el diagnóstico, una vez descartados otro
tipo de problemas (3). En este sentido, en el ya citado estudio AsmaCost se
encontró que el coste del paciente asmático era sustancialmente menor si el
diagnóstico se basaba en la presencia de hiperrespuesta bronquial en
comparación a cuando se hacía sólo a partir de la clínica, lo que refuerza la
importancia de realizar un diagnóstico certero del asma (9).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
6
1.2. Historia natural
En cuanto a la historia natural de esta enfermedad, el asma, por lo
general comienza en los primeros años de la vida. En casi el 50% de los
casos, el pico de inicio se sitúa antes de los 10 años. Casi la tercera parte
de los niños menores de 3 años presenta en alguna ocasión sibilancias,
generalmente en el curso de una infección viral, y muchos de ellos tendrán
al menos una recurrencia. No obstante, no todos los niños con síntomas de
asma los mantienen en la vida adulta. Se ha investigado exhaustivamente
sobre los factores determinantes de la evolución de esta enfermedad.
Los datos disponibles en la actualidad sobre la historia natural del
asma proceden de estudios longitudinales de cohortes y de base
poblacional; a pesar de sus limitaciones, estos estudios llevados a cabo en
distintos países han aportado datos muy interesantes sobre la génesis y
progresión del asma y sobre los posibles factores de riesgo implicados. En
buena medida, los resultados de estos trabajos nos orientan a que el patrón
de asma durante la infancia nos va a ayudar a predecir, con una elevada
probabilidad, lo que va a ocurrir en la vida adulta. Así, los niños con asma
episódica evolucionarán por lo general a la curación completa y solo un
pequeño porcentaje presentará síntomas intermitentes o persistentes leves
sin repercusiones funcionales. Por el contrario, la mayoría de niños con
asma persistente tendrán reducida su función pulmonar y continuarán
presentando síntomas en la vida adulta (2).
1.3. Conceptos de gravedad, control del asma y
exacerbaciones
Los conceptos de gravedad y control de asma son importantes para
evaluar al paciente asmático y su respuesta al tratamiento, así como para
los servicios de salud, registros y estudios de investigación. Por desgracia,
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
7
con frecuencia, la terminología aplicada no está estandarizada y los
términos se confunden e intercambian. Es sumamente importante
diferenciar el asma grave del asma no controlada.
1.3.1. Gravedad: la gravedad es una característica intrínseca de la
enfermedad de base y, en cambio, el control, una valoración que se
establece una vez que se ha instaurado el tratamiento, siendo la principal
meta de éste (1, 12). Debe ser un objetivo prioritario intentar conseguir
tanto el control de los síntomas diarios como el del riesgo futuro, sobre todo
en la aparición de exacerbaciones. En la presentación inicial de la
enfermedad, si el paciente no está recibiendo tratamiento de
mantenimiento, se debe valorar la gravedad en función de la presencia de
síntomas diurnos y nocturnos, del uso de medicación de rescate, de la
limitación de la actividad, de la función pulmonar y del número de
exacerbaciones, para después clasificarla en asma intermitente, persistente
leve, persistente moderada o persistente grave, e instaurar el tratamiento
farmacológico adecuado según la gravedad (3, 12). Una vez que el paciente
está siendo tratado, la gravedad depende del escalón terapéutico que
precise para lograr el control de la enfermedad (12).
1.3.2. Control del asma: Se entiende que el asma está controlada
cuando tanto la sintomatología diurna como la nocturna desaparece o es
escasa, el número de exacerbaciones, las visitas a urgencias y los ingresos
hospitalarios son mínimos o nulos, la función pulmonar es normal o próxima
a la normalidad, no es necesario el uso de medicación de rescate y no
existen limitaciones para la actividad diaria, incluido el ejercicio físico (12).
Un mal control del asma se asocia a peor calidad de vida, limitación
de las actividades diarias, pérdida de horas de trabajo o de asistencia a la
escuela, mayor gasto sanitario y mayor riesgo de presentar exacerbaciones
que requieran asistencia en los servicios de urgencias e ingresos
hospitalarios. El periodo mínimo para evaluar el control es de 1 a 4 semanas
en los adultos y de al menos 4 semanas en el caso de los niños, antes de
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
8
que el paciente acuda a consulta (14). Aunque se han desarrollado varios
cuestionarios para evaluar el control del asma, ninguno evalúa de forma
adecuada las exacerbaciones que, como acabamos de mencionar, son de
gran importancia para definir el control de la enfermedad (15).
1.3.3. Exacerbaciones: Son episodios caracterizados por un
aumento progresivo de la disnea, tos, sibilancias y opresión torácica, o una
combinación de estos síntomas, y que varían, tanto en el inicio como en la
resolución, de minutos a semanas. Las exacerbaciones son, sin ninguna
duda, la variable más utilizada en la investigación de la eficacia de los
tratamientos del asma. Controlar la enfermedad de base y las
exacerbaciones probablemente se consiga incidiendo en distintos factores
(15). Diferenciamos tres tipos de exacerbaciones:
Las exacerbaciones graves son aquellas que requieren tratamiento
urgente para evitar la hospitalización e incluso la muerte del paciente. Suele
ser un indicador de mal control del asma y deben incluir al menos uno de
los siguientes criterios: uso de corticoides sistémicos o un incremento de la
dosis de corticoides orales al menos 3 días consecutivos, hospitalización o
visita a Urgencias por asma con requerimiento de corticoides sistémicos.
Aunque las exacerbaciones graves son más frecuentes en el asma grave y,
por tanto, aumentan su mortalidad, también se presentan, en una
proporción mayor a la esperada en el asma leve (16).
Las exacerbaciones moderadas son aquellas que precisan un cambio
temporal en el tratamiento para evitar su evolución a una exacerbación
grave. Se deben cumplir, durante 2 o más días, uno o más de los siguientes
criterios: deterioro de los síntomas, empeoramiento de la de la función
pulmonar y aumento del uso de la medicación de rescate (14). Las visitas a
Urgencias que no precisen corticoides sistémicos se clasificarán como
exacerbaciones moderadas.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
9
Las exacerbaciones leves son aquellas que ceden con tratamiento de
rescate, no precisan asistencia en servicios de urgencias, no conllevan un
deterioro persistente de los síntomas ni de la función pulmonar y no alteran
significativamente la calidad de vida del paciente. Requieren, solamente, un
ajuste en el tratamiento de base si son frecuentes.
Los principales desencadenantes de las exacerbaciones son las
infecciones virales (en especial por rinovirus), la exposición a
aeroalérgenos, a algunos contaminantes medioambientales, a sustancias e
irritantes presentes en el medio laboral y a fármacos como los analgésicos
antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).
1.4. Estudios de asociación genética y asma
La comprensión de los principios básicos de los estudios de asociación
genética es sumamente importante, ya que sus resultados afectan por igual
a todos, tanto a pacientes como a profesionales de la medicina y/o de la
investigación. Aunque existe el convencimiento general entre profesionales
de que aún es pronto para obtener conclusiones fiables, ya existen
compañías que ofrecen test de susceptibilidad genética para un amplio
rango de enfermedades comunes, incluida el asma.
El polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una
población de múltiples alelos de un gen. Es decir, un polimorfismo es una
variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los
individuos de una población.
Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o
reguladora y que producen cambios importantes en la estructura de la
proteína o en el mecanismo de regulación de la expresión, pueden
traducirse en diferentes fenotipos (por ejemplo, el color de los ojos).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
10
Un polimorfismo puede consistir en la sustitución de una simple base
nitrogenada (por ejemplo, la sustitución de una A (adenina) por una C
(citosina) o puede ser más complicado (por ejemplo, la repetición de una
secuencia determinada de ADN, donde un porcentaje de individuos tenga un
determinado número de copias de una determinada secuencia).
Existen diferentes tipos de polimorfismos:
• Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, del inglés: Single
Nucleotide Polymorphism).
• Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, del
inglés: Restriction Fragment Length Polymorphism).
• Polimorfismos en el número de repeticiones en tandem (VNTR, del
inglés: Variable Number Tandem Repetition).
1.4.1. Características
Los métodos utilizados para descubrir nuevos genes asociados a
asma han evolucionado con el tiempo, a medida que las técnicas de
genotipado han mejorado en rentabilidad y han abaratado los costes. En la
actualidad, se ha empezado a utilizar técnicas capaces de secuenciar la
totalidad del genoma (Next Generation: NextGen) (17). El descubrimiento
de genes está cada vez menos limitado a las técnicas de secuenciación,
siendo el principal impedimento para su desarrollo total el gran
requerimiento bioinformático que precisan, así como la interpretación y
análisis de la enormidad de datos que se obtienen.
Existen diferentes tipos de estudios cuya finalidad es localizar genes,
o variables genéticas, asociados estadísticamente a unas características
predeterminadas:
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
11
1.4.2. Estudios de asociación de gen candidato
El método más utilizado es el estudio de casos y controles, en el que
se busca una determinada marca (generalmente polimorfismos de un solo
nucleótido o SNPs), un alelo o un haplotipo, en casos (individuos con el
fenotipo) comparado con los controles (individuos sin el fenotipo: “super
controles”, o individuos de la población general de los que se desconoce el
fenotipo: “controles poblacionales”).
Tal y como indica el nombre, los genes son seleccionados para este
estudio en función de lo que previamente conocemos sobre ellos, ya sea su
función (gen candidato por función), su localización cromosómica (tras
estudios de ligamiento de todo el genoma), o por su proximidad a una
asociación conocida (gen candidato posicional).
La variante a analizar en este estudio se puede seleccionar
basándonos en su función (por ejemplo: sustitución de un aminoácido que
se sabe influye en la función de la proteína o un SNP en la región promotora
que se sabe afecta a la transcripción), o en estudios de asociación previos
con la misma enfermedad o enfermedades relacionadas.
Estas estrategias requieren un conocimiento previo sobre la
estructura del haplotipo del gen, así como cierta habilidad para seleccionar
los SNPs que engloben todos los haplotipos. Estos SNPs seleccionados no
deben estar en desequilibrio de ligamiento entre sí, por el contrario, sí
deben estarlo con aquellos SNPs que no se genotiparán en el estudio (tag
SNPs) (18, 19). De esta manera, se reduce considerablemente el número
de SNPs seleccionados por cada gen. Este número varía entre 10 y algunos
cientos, dependiendo del tamaño del gen, la estructura del haplotipo y los
criterios para determinar desequilibrio de ligamiento.
Dado que en los estudios de gen candidato la selección de genes se
basa en una hipótesis previa, las asociaciones descubiertas con este método
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
12
son sencillas de interpretar, siendo esta una de las principales ventajas de
este tipo de estudio.
La mayoría de los estudios genéticos realizados hasta la fecha en
asma han sido de asociación de gen candidato, y los genes se han
seleccionado debido al conocimiento previo de su función o por su posible
implicación en la patogénesis del asma (20, 21). Por este motivo, la
principal limitación de estos estudios es que están circunscritos a lo que
sabemos, o creemos que sabemos, sobre la enfermedad en cuestión, su
patogénesis y la función de los genes. Los estudios de asociación de gen
candidato no pueden, por si mismos, descubrir nuevos genes implicados en
la enfermedad ni novedades en su patogenia.
1.4.3. Estudios de todo el genoma
A diferencia de los estudios de gen candidato, en este caso no es
necesaria una hipótesis previa ni conocimientos explícitos sobre la
patogenia de la enfermedad o fenotipo a estudiar. De hecho, los estudios de
aproximación de todo el genoma son conocidos como “estudios sin
hipótesis” o “estudios generadores de hipótesis”. Su ventaja es, por lo
tanto, que son capaces de descubrir nuevos genes y nuevas vías en la
fisiopatogenia de la enfermedad. El inconveniente, por el contrario, es la
gran carga estadística resultante del alto número de pruebas que se hacen
simultáneamente y que requieren un tamaño muestral muy elevado para
lograr resultados estadísticamente significativos. Además, la relación entre
las variantes encontradas y la enfermedad no siempre es tan evidente (22).
1.4.3.1. Estudios de ligamiento de todo el genoma: Para llevar a cabo este
tipo de estudio de aproximación genética se necesitan familias en las
que existan al menos dos miembros con la enfermedad (fenotipo), casi
siempre pares de gemelos. El estudio de ligamiento se basa en la
premisa de que el locus con el fenotipo se hereda junto con la
enfermedad en las familias, de modo que la región del gen que confiere
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
13
susceptibilidad estará presente entre los afectados con más frecuencia
de lo esperado por el azar.
La principal ventaja de los estudios de ligamiento es que mostrarán
genes que contienen variantes poco frecuentes que confieren un riesgo
elevado de padecer la enfermedad. Su principal inconveniente es que
identifica regiones cromosómicas muy amplias, capaces de albergar
cientos de genes (baja resolución) y que tiene una limitada capacidad
para detectar variantes que confieran un riesgo modesto de padecer la
enfermedad.
1.4.3.2. Estudios de asociación de todo el genoma (GWAS): La ventaja
fundamental de los GWAS es su excelente resolución y su capacidad
para detectar variantes con una implicación modesta sobre la
enfermedad. En este caso no es necesario el estudio de familias (23), es
más, la muestra debe ser homogénea en cuanto a raza y etnia se refiere
y las familias deben ser excluidas. Normalmente un GWAS busca
asociación entre un millón o más de SNPs. Los niveles de significación
estadística exigidos para considerar las asociaciones son muy rigurosos
(habitualmente con P < 10-7) y por este motivo las muestras deben ser
muy extensas. Esta es una de sus principales limitaciones y, por ello,
para solventarlo, se ha llevado a cabo un gran número de meta-análisis
en trabajos de cooperación nacional e internacional. Recientemente se
han publicado los resultados de dos meta-análisis de GWAS en asma:
• El consorcio GABRIEL (24) (Estudio multidisciplinar para identificar
las causas genéticas y ambientales del asma en la comunidad
europea): se han incluido 10365 casos y 16110 controles de
población europea caucásica extraídos de 23 estudios
independientes y el genotipado de 582892 SNPs.
• El consorcio EVE (25) (Estudio de colaboración entre
investigadores norteamericanos para identificar genes con
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
14
predisposición al asma entre poblaciones de distintas etnias): se
han incluido tres grupos poblaciones bien definidos y obtenidos de
nueve investigaciones:
• Europeos-americanos: 1486 casos, 1539 controles y 620 tríos
caso-padres.
• Afroamericanos y Caribeños-africanos: 1154 casos, 1054
controles y 413 tríos caso-padres.
• Latinos: 606 casos, 792 controles y 413 tríos caso-padres.
La principal limitación de los GWAS es que detectan solo variantes
comunes, ya que las plataformas de genotipado incluyen habitualmente
variantes comunes, y tienen una potencia muy baja para detectar
asociaciones de SNPs con frecuencias alélicas menores del 1%; así la
frecuencia del alelo menor (MAF) en la población, se clasifica en variante
común o variante rara según sea su frecuencia mayor o igual al 1% o
menor del 1%, respectivamente. Esto sugiere que las asociaciones
genéticas detectadas de este modo son solo una pequeña proporción de
la heredabilidad de la enfermedad (“missing heritability”) (26-28). Las
variantes alélicas poco frecuentes, las que no detectan los GWAS, tienen
un efecto mucho mayor sobre la expresión de la enfermedad que las
variantes frecuentes, desafiando de este modo la hipótesis de
“enfermedad común-variantes comunes”, básica al desarrollar estudios
GWAS.
1.4.4. Estudios de resecuenciación
El desarrollo de técnicas de alto rendimiento para la secuenciación
masiva en paralelo del genoma (NexGen), están permitiendo llevar a cabo
estudios de asociación que consiguen identificar, no solo variables comunes,
sino también las menos frecuentes, así como variables estructurales, tales
como variaciones en el número de copias (CNVs) y delecciones (indels), que
no detectaban los GWAS ni otros estudios centrados en la variabilidad de
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
15
SPNs. Estos estudios se fundamentan en el convencimiento de que
variaciones genéticas poco frecuentes tienen un efecto importante sobre la
enfermedad, y son capaces de explicar una proporción significativa del
riesgo genético en enfermedades comunes como el asma (29, 30).
Las limitaciones para seleccionar un método u otro han variado
mucho con el paso de los años. Las mejoras tecnológicas y el abaratamiento
de precios han permitido a los investigadores ampliar considerablemente el
abanico de posibilidades de elección. La decisión final estará condicionada
inicialmente por factores extrínsecos a la patología, principalmente recursos
económicos y el tamaño de la muestra. Salvando este impedimento, la
mejor elección dependerá del verdadero mapa genético que predispone al
asma, lo cual, por desgracia, no se conoce en la actualidad.
Si el principal riesgo genético de padecer asma son muchas variantes
comunes con un efecto modesto sobre la enfermedad, los GWAS y los
meta-análisis de GWAS se perfilan como la mejor opción. Considerando la
hipótesis contraria, la resecuenciación o los estudios de ligamiento de todo
el genoma serían los más recomendables. En todo caso, es posible que el
riesgo genético de padecer asma sea una combinación de ambas, por lo que
una combinación de estudios de aproximación parece ser lo más adecuado,
al menos hasta que nuestros conocimientos sean más certeros.
1.5. Genes asociados con asma
Se han realizado más de veinte estudios de ligamiento para asma y
fenotipos relacionados, identificándose al menos diez regiones
cromosómicas con genes potencialmente relacionados con el asma.
Utilizando estudios de clonación posicional sobre estas regiones, se han
identificado seis nuevos genes asociados al asma. Tres de ellos ejercen su
actividad sobre la mucosa, afectando directamente al epitelio bronquial.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
16
Otros afectan directamente a la arquitectura pulmonar o interactúan con
citocinas inflamatorias.
Los estudios de asociación determinan la relación existente entre
fenotipos específicos o características de una enfermedad y la presencia de
alteraciones alélicas de una determinada marca de ADN. Se han descritos
millones de polimorfismos (principalmente de sustitución, inserción o
delección) en los 20.000 - 25.000 genes que, entre los tres billones de
pares de bases, componen el ADN humano. La “base de datos de la
asociación genética” (GAD, de sus siglas en inglés: Genetic Association
Datebase), contiene información sobre más de 500 publicaciones de
asociación genética con asma (40).
La revisión de estos estudios identificó 25 genes cuya asociación con
asma o fenotipos relacionados ha sido replicada en seis o más poblaciones,
así como, otros 54 genes replicados en entre dos y cinco poblaciones
diferentes. Se desconoce la función de muchas de las variantes genéticas
identificadas en estudios de ligamiento y asociación, a pesar de haberse
examinado también variantes genéticas con efectos bioquímicos conocidos
in vitro.
Algunas de las regiones más representativas o de los genes más
replicados (y, en algunos casos, variantes funcionales de los mismos) son:
1.5.1 Dipeptidil peptidasa X (DDP10): Esta región está localizada en el
cromosoma 2q14 próxima al gen de la IL-1. Cuatro estudios de
ligamiento de todo el genoma y dos estudios en ratón han encontrado
asociación con asma anteriormente. Además, en dos grupos de
familias con asma, de origen alemán y británico, se ha encontrado
una asociación significativa entre SNPs en DDP10 y asma (31).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
17
1.5.2 Disintegrina A y metaloproteinasa 33 (ADAM33): Un GWAS
realizado en un amplio grupo de familias inglesas determinó
evidencias de ligamiento con el cromosoma 20p13. Mediante estudios
de clonación posicional y genotipado de 135 SNPs en 23 genes, se
identificó un gen asociado significativamente a asma. Este gen
codifica el dominio 33 de una disintregrina y metaloproteinasa A. El
ADAM33, fue el primer gen identificado por clonación posicional y
asociado con el desarrollo de asma y de hiperreactividad bronquial
(32). Se ha especulado que el gen ADAM33, expresado en las células
musculares lisas de la vía respiratoria y en fibroblastos de pulmón,
codifica la síntesis de una proteína importante para la fusión,
adhesión y señalización celular, así como para la proteólisis. Por otra
parte, se ha sugerido que ADAM33 desempeña, también, un papel en
la remodelación de la vía aérea (33, 34).
1.5.3 Receptor acoplado a proteína G (GPRA): Los primeros estudios
publicados de ligamiento de todo el genoma apuntaban a que el
cromosoma 7p era muy relevante. Estos hallazgos se replicaron en
estudios que incluían familias canadienses y finlandesas y se
confirmaron con posterioridad en familias de procedencia australiana
(35-37). Estudios de clonación posicional con 103 tríos (caso-padres)
procedentes de Finlandia han identificado un gen que codifica una
proteína G acoplada a un receptor que confiere susceptibilidad para
asma y se ha replicado en familias de origen canadiense (38).
1.5.4 Protocadherina 1 (PCDH1): Tanto el asma como la
hiperreactividad bronquial se han asociado a SNPs en el cromosoma
5q31-q33. Mediante estudios de ligamiento y secuenciación, se ha
identificado al gen de la protocadherina 1, PCDH1, que codifica a una
proteína de adhesión expresada en macrófagos alveolares y en
células epiteliales de la vía aérea. En siete de ocho estudios
poblaciones, las variantes en PCDH1 se han asociado con
hiperreactividad bronquial (39).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
18
1.5.5 Gen de filagrina: La filagrina es una proteína llave que facilita la
diferenciación final de la epidermis y la formación de la barrera
defensiva de la piel. Dos variantes nulas de pérdida de función en el
gen de la filagrina (R501X y 2282del4) predisponen a dermatitis
atópica y se asocian con los niveles de IgE total (41, 42). Estas
variaciones también se asocian significativamente con asma en
pacientes con dermatitis atópica en algunos estudios (41), aunque en
otros parecen no influir con la susceptibilidad a padecer asma ni con
la gravedad de la misma (42).
1.5.6 Gen de ORMDL3 (Tipo orosomucoide 3): Este gen codifica a una
proteína transmembránica asociada al retículo endoplasmático y se
localiza en el cromosoma 17q. El primer GWAS identificó marcas en
este loci asociadas con asma de comienzo en la infancia en población
europea (43). Estos resultados se han replicado en poblaciones
españolas, europeas (24, 44-51) y asiáticas (50-52).
1.5.7 Gen del receptor adrenérgico ββββ-2: El gen que codifica al receptor
adrenérgico β-2 está situado en el cromosoma 5q31 (53). Codifica
una proteína con siete dominios transmembrana que pertenece a la
familia de receptores acoplados a la proteína G. Se expresa en
distintas células en el pulmón, tales como musculares lisas,
epiteliales, vasculares, y células inflamatorias, como mastocitos,
eosinófilos y linfocitos. Algunos SNPs de este gen se han asociado con
hiperreactividad bronquial y con la respuesta a broncodilatadores. Es
el caso, por ejemplo, de los individuos homocigotos Gly 16, los cuales
tienen una respuesta menor a broncodilatadores y, al mismo tiempo,
desarrollan más rápidamente taquifilaxia a esta medicación en
comparación con aquellos que presentan el fenotipo salvaje, es decir,
homocigotos Arg 16 (54, 55). La relevancia clínica de los distintos
SNPs identificados en este gen, sin embargo, no está totalmente
esclarecida a día de hoy. Se han asociado SNPs de este gen con la
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
19
presencia de asma nocturna y con variaciones en los niveles
plasmáticos de IgE, pero no con un mayor riesgo de padecer asma
(54, 56-58). Son necesarios más estudios para aclarar el papel de la
disfunción del receptor, tanto en el desarrollo como en la evolución
del asma y por el momento, parece que tampoco es fiable utilizar
estos SNPs como predictivos de la respuesta a broncodilatadores.
1.5.8 Gen del receptor de interleucina 4 (IL4R): En un estudio de
casos controles, se encontró una asociación entre una variante
polimórfica en el receptor de la IL-4 (-589C/T) y la presencia de
atopia, definida ésta como elevación de IgE total o de IgE específica
(59). En estudios in vitro realizados con células mononucleares de
sangre periférica, se ha encontrado que los individuos heterocigotos
para esta mutación tienen el doble de CD23 (receptor de baja
afinidad para la IgE) en respuesta a la IL-4, mientras que los
individuos homocigotos para la mutación tienen el triple. Estos
resultados se han reproducido en otras poblaciones y en estudios de
asociación en familias (60-66).
1.5.9 Genes asociados con asma mediante GWAS
Como ya se ha comentado en otros estudios genéticos, la principal
limitación de los estudios de gen candidato es que la selección de dicho gen
se basa, con frecuencia, en unos conocimientos limitados y cada
polimorfismo en cada gen candidato contribuye modestamente en la
heredabilidad de enfermedades complejas como el asma (67). Datos del
HapMap Project (www.hapmap.org), junto con procedimientos más exactos
para seleccionar marcas en el genoma, muchas de ellas en desequilibrio de
ligamiento con otras, lo suficientemente numerosas y dispersas como para
identificar la mayoría de variantes cromosómicas, han permitido que los
estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) reemplacen a los
estudios de gen candidato en la búsqueda de genes responsables de
patologías complejas como el asma.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
20
Aproximadamente una docena de GWAS han publicado asociación con
asma o fenotipos relacionados. Estos estudios se han llevado a cabo
principalmente en poblaciones europeas, con escasa reproductividad en
grupos étnicos diferentes (43, 68-71). Los trabajos más representativos
son:
1. El primer GWAS (43) determinó una asociación reproducible entre
asma de aparición en la infancia y marcas cerca del gen ORMDL3 en
el cromosoma 17q21.
2. El segundo GWAS realizado demostró asociación entre una variante
en el promotor del gen de la quitinasa 3-L1 (CHI3L1), que codifica
YKL-40, con asma, hiperreactividad bronquial y disminución de la
función respiratoria. (58-63). La variante del gen CH13L1 tiene una
importante asociación con los niveles séricos de YKL-40, sugiriendo
que éste puede ser un biomarcador para asma (68).
3. Mediante GWAS, también se ha objetivado asociación entre niveles
séricos de IgE total y variantes funcionales del gen de la cadena α del
receptor de alta afinidad de la IgE (FcER1α) (69).
4. En un GWAS con 10336 individuos con diagnóstico médico de asma y
16110 individuos no afectados, se encontraron las siguientes
asociaciones (24):
o Cromosoma 2, implicando a los receptores de la IL-1 y la IL-
18.
o Cromosoma 6, implicando a HLA-DQ.
o Cromosoma 9 , implicando a IL-33.
o Cromosoma 22, implicando a la unidad β del receptor de la IL-
2.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
21
o Variantes en la localización de ORMDL3 en el cromosoma
17q21 se relacionaron específicamente con asma de aparición
en la infancia.
o Localizaciones fuertemente relacionadas con los niveles de IgE
total no se asociaron con asma.
5. En un metaanálisis de GWAS en población americana de diversidad
étnica, se reprodujeron cuatro asociaciones con localizaciones
cromosómicas en 17q21, cerca de IL1RL1, estroma tímico
linfoproliferativo (TSLP) e IL33. A diferencia de lo que sucede en
otras publicaciones, estas asociaciones han resultado
estadísticamente significativas con asma en grupos de tres etnias
diferentes. También han identificado, por primera vez, una asociación
con asma específica para etnia afroamericana. Se trata de una nueva
localización que codifica a una proteína inducible por interferón
(PYHIN1), que se asocia específicamente con individuos de
descendencia africana (25).
Los GWAS, sin embargo, no han demostrado asociaciones significativas
con variantes cromosómicas vinculadas a la vía de los leucotrienos.
1.6. Leucotrienos
Los leucotrienos (“Leuco” por leucocitos y “trienos” de tres dobles
enlaces conjugados) son una familia de ácidos grasos derivados del
metabolismos del ácido araquidónico por la vía de la 5-lipoxigenasa. Los
cisteinil-leucotrienos C4, D4, E4 (CysLT) son responsables de la actividad
biológica de los productos que antiguamente se denominaban “sustancias
de reacción lenta de la anafilaxia”. Fueron descubiertos en 1979 por el
bioquímico de origen sueco Bengt Samuelsson, Premio Nobel de Fisiología o
Medicina en 1982, por su trabajo sobre las prostaglandinas. La eficacia de
los antagonistas del receptor del CysLT de tipo 1 (CysLT1) en el asma valida
la importancia de los CysLT y del CysLT1 en esta enfermedad (72).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
22
La síntesis de leucotrienos a partir del sustrato ácido araquidónico se
inicia por la acción de la 5-lipoxigenasa (5-LO) en colaboración con la
proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) (73). Aunque la FLAP no
tiene actividad enzimática (Figura 1), aumenta la capacidad de la 5-LO para
interactuar con su sustrato. El leucotrieno A4 (LTA4) se convierte, por
efecto de la hidrolasa del LTA4, en leucotrieno B4 (LTB4), o también se
puede conjugar con glutatión, reducido por acción de la sintasa del
leucotrieno C4 (LTC4), para producir LTC4. Proteínas transportadoras
específicas desplazan al LTB4 y al LTC4 al exterior de la célula. El LTC4
liberado se convierte en leucotrieno D4 (LTD4), que pasa a ser leucotrieno
E4 (LTE4) por hidrólisis secuencial de sus aminoácidos. La capacidad de
generar grandes cantidades de leucotrienos a partir del ácido araquidónico
es prácticamente exclusiva de los leucocitos; no obstante, las cantidades de
LTB4 y de cisteinil-leucotrienos que producen los distintos tipos de
leucocitos depende de las enzimas distales hidrolasa del LTA4 y sintasa del
LTC4, respectivamente.
En general, solo los leucocitos tienen suficiente 5-LO y FLAP para
sintetizar cantidades apreciables de leucotrienos a partir de ácido
araquidónico, si bien hay que tener presente que las células que expresan
enzimas metabolizadoras del LTA4 distal pueden captar LTA4 derivado de
los leucocitos y metabolizarlo en leucotrienos bioactivos, proceso que se
denomina “biosíntesis transcelular”. La colaboración entre neutrófilos y
células endoteliales es un ejemplo de este fenómeno.
La síntesis de leucotrienos se encuentra regulada por la cantidad de
ácido araquidónico libre que la fosfolipasa A2 (PLA2) libera de los
fosfolípidos de la membrana celular (74, 75), el nivel de cada una de las
proteínas de la vía 5-LO, la actividad catalítica por molécula enzimática
(p.ej., modulada por la fosforilación mediada por proteincinasas) (76) y la
disponibilidad de moléculas pequeñas (p.ej., ATP, óxido nítrico e
intermediarios del oxigeno reactivo) (77), que modulan a su vez la actividad
de la 5-LO.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
23
Figura 1: Síntesis de leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos.
Otra variante que influye en la síntesis de leucotrienos es la
localización intracelular de la 5-LO. El desplazamiento de la 5-LO desde el
nucleoplasma a la membrana nuclear interna conlleva la síntesis máxima de
LTB4 (78).
Los déficits hereditarios de enzimas en la vía de síntesis de los
leucotrienos son poco frecuentes (79), pero se han descrito variantes
alélicas de las regiones codificante y promotora de los genes que codifican
la 5-LO (80), la FLAP (81), la hidrolasa del LTA4 (82) y la sintasa del LTC4
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
24
(83). Por otra parte, la transcripción de dichos genes se puede regular
mediante citocinas (84, 85), tales como el factor transformador de
crecimiento β (TFG-β), distintas leptinas, endotelinas, vitamina D3,
endotoxinas (86) y corticoides. Por ejemplo, la expresión de la sintasa de
LTC4 se regula al alza por acción de la IL-4 (85) y a la baja por endotoxinas
(86).
Las principales características de los diferentes metabolitos de la vía
de la 5-LO, así como de los receptores implicados en su actividad biológica,
se resumen en la “Tabla 1”.
Tabla 1. Leucotrienos: Receptores, enzimas y mediadores
BLT1 Receptor uno del leucotrieno B. Es un receptor acoplado a proteína G
con gran afinidad por el LTB4.
BLT2 Receptor dos del leucotrieno B. Es un receptor acoplado a proteína G
con gran afinidad por el LTB4.
CysLT1 Receptor uno de los cisteinil-leucotrienos (CysLT). Es un receptor
acoplado a proteína G que reconoce a los cisteinil-leucotrienos por
orden de afinidad (en primer lugar al LTD4, seguido del LTC4 y por
último al LTE4). Es la diana de fármacos antileucotrienos como el
montelukast, el zafirlukast y el pranlukast.
Su activación produce dilatación de vasos sanguíneos con incremento
de la permeabilidad vascular, hipersecreción mucosa, contracción de
la musculatura lisa bronquial, aumento de la migración
transendotelial de células hematopoyéticas CD34+ y eosinófilos y
aumento de la producción mastocitaria de IgE dependiente de IL-5 y
TNF.
CysLT2 Receptor dos de los CysLT. Es un receptor acoplado a proteína G que
reconoce a los CysLT por orden descendente de afinidad (en primer
lugar al LTC4 y al LTD4 seguido del LTE4). Produce activación de
células endoteliales.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
25
Tabla 1. (continuación) Leucotrienos: Receptores, enzimas y mediadores
5-LO 5-lipoxigenasa. Enzima que inicia la síntesis de leucotrienos a partir
del ácido araquidónico.
FLAP Proteína activadora de la 5-LO. Aunque no tiene actividad enzimática,
aumenta la capacidad de la 5-LO para interactuar con su sustrato.
LTA4 Leucotrieno A4. Producto inestable de la acción de la 5-LO sobre el
sustrato ácido arquidónico y precursor del LTB4 y de los CysLT.
Hidrolasa
de LTA4
Enzima que hidroliza LTA4 para formar LTB4.
LTB4 Leucotrieno B4. Producto de la acción de la LTA4 hidrolasa sobre el
LTA4. Potente quimiotáctico y activador de los leucocitos.
Sintasa de
LTC4
Enzima que conjuga el glutatión con el LTA4 para formar LTC4.
CysLT Cisteinil-leucotrienos. Incluye el LTC4, LTD4 y el LTE4. En todos ellos
el aminoácido cisteína está conjugado a la base lipídica.
LTC4 Leucotrieno C4. Producto de la acción de la sintasa de LTC4 sobre
LTA4. Precursor de los restantes CysLT.
LTD4 Leucotrieno D4. Metabolito del LTC4. Es el más potente de los CysLT
en cuanto a la contracción del músculo liso de las vías respiratorias
por ligación al receptor CysLT1.
LTE4 Leucotrieno E4. Metabolito del LTD4 y producto final de todos los
CysLT. Se puede medir en orina.
1.6.1. Leucotrienos y su implicación en el asma
El paradigma actual de la patogenia del asma otorga gran
importancia a la interacción entre los genes y el ambiente. Según este
modelo, existen factores lesivos para el epitelio (tabaco, virus, sustancias
químicas…) y de susceptibilidad local de la vía aérea, que ponen en marcha
mecanismos de lesión–reparación, que tienden a perpetuarse en la unidad
trófica mesénquimo–epitelial. La exposición a aeroalérgenos y la atopia
inducen una respuesta Th2 con gran capacidad para favorecer y amplificar
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
26
las alteraciones inflamatorias y de remodelación de la vía aérea,
predisponiendo al fenotipo asmático. Esta hipótesis global explicaría como la
atopia puede darse sin asma y como el asma puede ocurrir en presencia o
ausencia de atopia (asma extrínseco e intrínseco, respectivamente), en
función de la intensidad de la agresión y de diferencias en la susceptibilidad
individual (87, 88). Los leucotrienos, junto a otros mediadores que
contribuyen al fenotipo asmático, provocan broncoconstricción al actuar
directamente sobre el músculo liso bronquial, e indirectamente al contribuir
a la hipersecreción mucosa, la vasodilatación, el aumento de permeabilidad
vascular y la actividad quimiotáctica para otras células y factores
inflamatorios, que contribuyen en la fisiopatogenia del asma.
La sobreproducción de leucotrienos en el asma se ha demostrado por
aumento de niveles de LTE4 en orina (89) y de CysLT y LTB4 en esputo
inducido de asmáticos comparado con población control. Este incremento es
mayor cuanto más grave es el asma (90) y aumenta tras exposiciones
bronquiales con aeroalérgenos. Por otro lado, los fármacos antileucotrienos
se han mostrado eficaces en el tratamiento del asma (91).
La implicación de los leucotrienos en la patogenia del asma es
relevante en todos los casos, independientemente de su asociación con
atopia. Sin embargo, la alteración en el metabolismo del ácido araquidónico,
ya sea por mediación de la vía de la 5-LO o de la cicloxigenasa-1 (COX-1)
(ver a continuación), es particularmente relevante en la “patología
respiratoria exacerbada por aspirina”, frecuentemente denominada “asma
inducido por acido acetil salicílico (AAS)”
1.7. Patología respiratoria exacerbada por aspirina
(AERD: Aspirin exacerbated respiratoty disease)
La AERD se define por la combinación de las tres características
clínicas siguientes:
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
27
1. Asma.
2. Rinosinusitis crónica con poliposis nasal.
3. Reacción adversa al AAS y otros inhibidores de la COX-1.
Los pacientes que presentan solo empeoramiento del asma inducido
por AAS u otros analgésicos del grupo de los antiinflamatorios no
esteroideos (AINEs), se incluyen también bajo esta denominación. El
término de AERD destaca la implicación de la vía aérea superior e inferior
en esta patología y la intolerancia a AINES como un desencadenante
importante, pero no imprescindible. La rigurosa evitación de AINEs, sin
embargo, no implica una mejoría en la rinitis y/o en el asma (92, 93).
El primer caso de sensibilización a AAS fue descrito en 1902, solo unos
años después de haber sido introducida esta medicación en el uso clínico.
En 1968, Samter y Beers describen la triada de síntomas característicos,
que en pocos años ya se conocería como “Triada de Samter” o “Triada AAS”
(94).
La AERD se diagnostica normalmente en la edad adulta, ya que la
afectación en niños y adolescentes es considerablemente menor. La
mayoría de los pacientes comienzan padeciendo rinitis persistente en la
tercera década de la vida. Los síntomas se intensifican de forma progresiva
presentando con frecuencia anosmia y poliposis. A medida que avanza la
inflamación de las vías respiratorias superiores, de forma característica, se
afectan las vías aéreas inferiores. En algún punto de esta progresión
aparece la intolerancia a AINES. El asma y la rinosinusitis de estos
pacientes empeoran con el tiempo, incluso realizando una rigurosa evitación
de AINEs (95).
La fisiopatología de AERD no está del todo aclarada. Existe una
sobreproducción de productos proinflamatorios derivados del metabolismo
del ácido araquidónico, en particular de leucotrienos. La inhibición de la
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
28
COX-1 por parte de los AINES implica una menor producción de
prostaglandina E2 (PGE2), reduciéndose por lo tanto el efecto inhibidor que
ésta ejerce sobre la 5-LO de la vía del ácido araquidónico y aumentando la
producción de leucotrienos. En consecuencia, resulta en un desequilibrio
entre mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios, a favor de los
primeros.
Como ya se ha mencionado, el ácido araquidónico se libera desde los
fosfolípidos de membrana y es metabolizado por diferentes vías, para
generar distintos mediadores lipídicos, tanto proinflamatorios como
antiinflamatorios. El metabolismo del ácido araquidónico mediado por la 5-
LO genera leucotrienos. Los CysLT (LTC4, LTD4, LTE4), son potentes
proinflamatorios e inducen broncoconstricción, secreción mucosa y edema
de la vía aérea. Además, son potentes quimiotácticos para eosinófilos,
aumentando su número en la vía aérea. El LTB4 es también proinflamatorio
y quimiotáctico para neutrófilos y monocitos (96-98).
El metabolismo de ácido araquidónico mediado por la vía de la COX,
también llamada prostaglandín sintetasa, genera prostaglandinas y
tromboxanos (Figura 1). La prostaglandina D2 (PGD2) es producida
fundamentalmente por mastocitos y tiene un efecto broncoconstrictor; sus
niveles basales son más altos en pacientes con AERD y se elevan tras
exposición a AAS (99). A su vez, la PGE2 es broncodilatadora y tiene un
potente efecto antiinflamatorio, debido, en gran parte, al afecto inhibidor
que ejerce sobre la producción de leucotrienos, disminuyendo la actividad
de la 5-LO.
En conclusión, en los pacientes con AERD se ha demostrado
concentraciones elevadas de moléculas proinflamatorias y disminuidas de
moléculas antiinflamatorias, tanto en situación basal como tras exposición a
AINEs (100, 101). Algunas de las alteraciones más significativas que se han
identificado en estos pacientes son las siguientes:
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
29
1. Existe un número mayor de mastocitos y eosinófilos activados en el
tracto respiratorio de pacientes con AERD. Ambas células tienen la
capacidad de producir grandes cantidades de LTC4 (102-104).
2. La sintasa del LTC4, responsable de la producción de LTC4 a partir de
LTA4 (proceso que tiene lugar en el citoplasma de eosinófilos,
basófilos, mastocitos y macrófagos), está sobreexpresada en
eosinófilos y otros leucocitos de la vía aérea superior e inferior de
pacientes con AERD (103-105).
3. Los leucocitos de la mucosa nasal en pacientes con AERD expresan
mayor cantidad de receptores de leucotrienos (106) y, al mismo
tiempo, una isoforma del receptor para PGE (EP-2) está descendida
(107).
4. Los niveles de lipoxina A1, mediador antiinflamatorio derivado de la
vía de la 5-LO, están bajos en pacientes con AERD (108).
5. Los niveles de PGE2 en tejido polipoideo y de vías respiratorias
inferiores de los pacientes con AERD están disminuidos en situación
basal y descienden más tras provocación con AAS. Como ya se ha
mencionado, la PGE2 es un importante inhibidor de la síntesis de
leucotrienos (109, 110).
6. La inhalación de PGE2 previene la reacción tras la inhalación de acetil
salicilato de lisina, así como el aumento de CysLT (111).
7. Los fármacos antileucotrienos, tanto los antagonistas de receptores
(montelukast) como los inhibidores de la síntesis (zileutón), bloquean
o atenúan la broncoconstricción tras exposición a AAS (97, 112, 113).
1.8. Genes de la vía de síntesis de leucotrienos. Vía de
la 5-Lipoxigenasa (5-LO)
Algunos de los genes que codifican las proteínas más importantes
involucradas en la formación de leucotrienos y sus receptores se describen
en la Tabla 2:
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
30
Tabla 2: Característica moleculares de los genes que codifican la vía de la
5-LO y sus receptores.
Genes Localización
genética.
Longitud del
gen (kb)
Número
de exones
Número de
residuos
proteicos
ALOX5 10q11.2 82 14 673
ALOX5AP 13q12 31 5 162
LTC4S 5q35 2.5 5 150
LTA4H 12q22 35 19 610
CYSLTR1 Xq13-q21 54.9 3 337
CYSLTR2 13q14 2.8 1 346
LTB4R1 14q11.2-q12 5 3 352
LTB4R2 14q11.2-q12 2.8 1 389
ALOX5: 5-Lipoxigenasa; ALOX5AP: Proteína activadora de la 5-Lipoxigenasa (FLAP); LTC4S:
Sintasa del leucotrieno C4; LTA4H: Hidrolasa del leucotrieno A4; CYSLTR1-R2: Receptor de
cisteinil leucotrienos 1 y 2 respectivamente; LTB4R1-R2: Receptor del leucotrieno B4 1 y 2
respectivamente.
El gen de la 5-LO (ALOX5) se localiza en el locus 10q11.2, tiene una
longitud de 82kb y codifica un polipéptido de 673 aminoácidos y 85 kDa
(114, 115). La señal de inicio de transcripción se localiza a 65 pares de
bases del codón de inicio ATG y no hay secuencias TATA ó CAAT en el
promotor. La actividad del gen se regula a nivel transcripcional,
manteniendo unos niveles basales constantes de ARNm que aumentan
rápidamente con la activación celular (116, 117). La transcripción de ALOX5
depende, en parte, de una región promotora rica en Guanina (G) y Citosina
(C), que contiene variantes genéticas de inserción–delección. La forma más
común contiene cinco motivos de unión en tandem a proteínas con dedo de
zinc (Sp1/Erg-1) (las proteínas con dedo de zinc se unen a series de
repeticiones en tandem). Se han descrito mutaciones caracterizadas por la
adición o delección de estos motivos (-GGGCGC-) (118-121). Otro nivel de
regulación es la translocalización (dependiente de calcio) de la 5-LO del
citoplasma a la membrana nuclear, para acercarla a su sustrato e
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
31
incrementar su actividad (78, 122). La FLAP es fundamental para la
actividad de 5-LO. Está compuesta por 162 aminoácidos, tiene un peso
molecular de 18 kDa y está codificada por el gen ALOX5AP. Dicho gen, a su
vez, está formado por cinco exones y cuatro intrones de mayor longitud,
localizados en el cromosoma 13q12. Análisis con DNAc han revelado que
esta proteína se encuentra altamente conservada en mamíferos (123).
Tanto la 5-LO como la FLAP actúan sobre el ácido araquidónico, que
es liberado de los fosfolípidos de membrana por la acción de la fosfolipasa
A2 (PLA2). La PLA2 contiene 749 aminoácidos y tiene un peso molecular de
85 kDa. Está codificada por un gen localizado en el cromosoma 1q25
(PLA2G4), cuya estructura genómica no está esclarecida todavía (124). Las
dos enzimas responsables de formar CysLT y LTB4 a partir de LTA4 son,
como ya se ha descrito con anterioridad, la sintasa del LTC4 y la hidrolasa
del LTA4, respectivamente. La sintasa del LTC4 tiene un peso molecular de
18 kDa y está formada por 150 aminoácidos. Está codificada por el gen de
la sintasa del LTC4, localizado en el cromosoma 5q35, y contiene 2.5 kb con
cinco exones. Presenta dos sitios de fosforilación potenciales de la proteína
C kinasa y un sitio de N-glicosilación. El 31% de los aminoácidos son
idénticos a los de FLAP y esta homología es especialmente relevante en la
región N-terminal. La estructura secundaria presenta 3 dominios
hidrofóbicos y 2 loop hidrofílicos. La sintasa del LTC4 de ratón también
contiene 150 aminoácidos y el 88% de la secuencia es similar a la del
humano; las diferencias entre la sintasa del LTC4 humana y la del ratón se
sitúan en 18 aminoácidos, de los cuales 9 se localizan en la región carboxi-
terminal de la proteína del ratón (125). En estudios de promotores se ha
identificado tres sitios posibles de inicio de la transcripción, localizados a -
96, -69 y -66 respecto de ATG. También se ha identificado algunas
secuencias de reconocimiento para factores de transcripción, tales como
Sp1, AP-1, AP-2 y GATA-1 (126).
La hidrolasa del LTA4 tiene 69 kDa de peso molecular, el gen que
codifica su síntesis está localizado en el cromosoma 12q22, compuesto por
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
32
35 kb y contiene 19 exones. Se ha descrito múltiples secuencias de
reconocimiento para factores de transcripción y un sitio posible de inicio de
la transcripción a -151 de ATG (127).
1.8.1 Asociación genética y asma
1.8.1.1. ALOX5: El 5´UTR del gen ALOX5 (5´UTR y 3´UTR: son dos partes
no traducidas de cada gen que se encuentran colindando el
“marco de lectura”) ha sido bien caracterizado. Mediante
resecuenciación de mutaciones en muestras de ADN de pacientes
asmáticos, en la región 176-146 bp corriente arriba de ATG
(región rica en GC), se observan adiciones de uno o delecciones
de uno o dos sitios de unión del factor de transcripción “dedos de
zinc” (Sp1/Egr-1), resultando en una menor capacidad de unión
de éste y una menor trascripción del gen (80, 128). La mutación
de las repeticiones en tandem del sitio de unión de Sp1 en la
región promotora ha sido objeto de varios estudios. Se ha
asociado con hiperreactividad bronquial, pero no con asma, en
algunas publicaciones (129, 130), y se ha propuesto como
marcador de gravedad en otras (121). Así mismo, otros autores
no han encontrado ninguna relación con asma ni fenotipos
relacionados (131). Se resumen estos hallazgos en la Tabla 3.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
33
Tabla 3: Gen ALOX5
Polimorfismo Localización Población Asociación Referencia
Japonesa No AERD Kawagishi y cols.
(129)
Coreana No asma
Sí AERD
Sí
hiperreactividad
bronquial
Kim y cols.(130)
UK
caucásica
No asma
No atopia
Sayers y cols. (131)
Repeticiones
de Sp1
P
Turca Sí gravedad
asma
Sí asma inducido
por ejercicio
Kalayci y cols. (121)
1.8.1.2. ALOX5AP: Se ha identificado dos polimorfismos en su región
promotora, un cambio Guanina por Adenina (A) en -336 y una
repetición de A en posición -169 hasta -146, dando lugar a los
alelos 19A y 23A. En una cohorte de 341 familias caucásicas con
asma, no se encontró asociación con asma analizando la región
promotora y la transcripción basal del gen (131). En una
publicación japonesa, sin embargo, se objetivó una asociación,
estadísticamente significativa, entre asmáticos y una mayor
frecuencia del alelo 21A comparado con controles (p=0.035)
(132)
En la actualidad, el gen ALOX5AP ha sido completamente
secuenciado y se han identificado múltiples SNPs, algunos de ellos
asociados a asma y fenotipos de atopia, lo que sugiere que
algunas marcas del gen son predictivas de susceptibilidad de la
enfermedad (81, 133) (Ver Tabla 4).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
34
Tabla 4: Gen ALOX5AP
Polimorfismo Localización Población Asociación Referencia
18A-21A
repeticiones
Japonesa Sí asma.
Koshino y cols.
(132)
23A-19A
repeticiones
Coreana No AERD
Kim y cols. (130)
-336 G>A, 23A-
19A
repeticiones
P
UK
caucásica
No asma
No atopia
Sayers y cols. (131)
SNPs:
G>A (SG13S25,
SG13S89)
T>A(SG13S114)
C>A (SG13S32)
A>G (SG13S41)
5´UTR
UK
caucásica
Sí asma y
fenotipos
relacionados con
atopia
Hollowat y cols.
(133)
1.8.1.3. Gen de la sintasa de LTC4 (LTC4S): Este gen codifica a la
principal enzima implicada en la síntesis de los CysLT y, por este
motivo, ha sido objeto de muchos estudios de asociación
genética. Destaca el SNP localizado en -444 corriente arriba de
ATG (-444 A>C, rs730012), que se ha asociado con asma,
intolerancia a AINEs y/o gravedad del asma en aproximadamente
la mitad de los estudios realizados (83, 129, 134, 135). Estudios
de SNPs diferentes de la región promotora (-1072 G>A) no han
encontrado asociación (136). Estos datos se resumen en la Tabla
5.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
35
Tabla 5: Gen de la sintasa del LTC4
Polimorfismo Localización Población Asociación Referencia
-1072 G>A UK
caucásica
No asma
No atopia
Sayers y cols. (136)
Japonesa Sí AERD
Kawagishi y cols.
(129)
Australiana
caucásica
Sí asma
Kedda y cols. (134)
UK
caucásica
Sí gravedad
asma
Sampson y cols.
(135)
-444 A>C
(rs730012)
P
Polaca Sí AERD Sanak y cols. (83)
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
36
2. HIPÓTESIS DE TRABAJO
El asma es una enfermedad multifactorial en la que influyen tanto
factores ambientales como genéticos. En los últimos años se han
identificado numerosos genes relacionados con el asma. Los estudios de
polimorfismos en dichos genes han intentado determinar su influencia en el
desarrollo de esta entidad.
Siendo el asma una enfermedad con un marcado componente
inflamatorio, muchos de los genes identificados son genes que codifican
citocinas, moléculas esenciales en el desarrollo de la respuesta inflamatoria.
Nuestra principal hipótesis de trabajo es que ciertas variantes génicas
que afectan a la vía de la síntesis de los leucotrienos podrían estar
relacionadas con el asma y con su gravedad.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
37
3. OBJETIVO
3.1. Objetivo primario
• Analizar el efecto de los polimorfismos LTCS -444 A/C, ALOX5 -176/-
147 y ALOX5AP -69/-146 en la susceptibilidad a padecer asma, y de
que ésta sea más grave, en la población de Gran Canaria.
• Reproducir en nuestra población estudios que señalan a estos
polimorfismos como factores de riesgo de esta enfermedad.
3.2. Objetivo secundario
• Identificar, si es posible, marcadores en el genoma que sean capaces
de permitir la caracterización de los pacientes analizados para, en un
futuro, predecir el riesgo de desarrollar asma e, incluso, mejorar la
calidad del manejo de dichos pacientes.
• Analizar la asociación entre los polimorfismos LTCS -444 A/C, ALOX5
-176/-147 y ALOX5AP -69/-146 y la intolerancia a AINEs, en nuestra
población.
• Analizar la asociación entre atopia e intolerancia a AINEs con el riesgo
a padecer asma de mayor gravedad.
• Evaluar la movilidad entre los distintos escalones de gravedad en el
asma (clasificación según los criterios clínicos de la GEMA) (3),
durante un periodo de un año, en los pacientes asmáticos incluidos
en el estudio y clasificados desde la primera consulta.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
38
4. MATERIAL Y METODOS 4.1. Estudio de casos y controles. Diseño.
Se analizaron un total de 193 pacientes no emparentados,
seleccionados entre los que acudían a consultas externas del Servicio de
Alergología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín (centro de
referencia para el área norte de la isla de Gran Canaria). Todos los
pacientes se incluyeron en un periodo de cinco meses. Una vez reclutados,
fueron atendidos en visitas trimestrales durante un periodo de un año. El
estudio fue presentado, revisado y aceptado por el Comité Ético del
Hospital. Todos los participantes, tanto del grupo de asmáticos como del
grupo control, fueron debidamente informados de las características del
estudio y firmaron un consentimiento informado antes de ser incluidos en
él.
Los principales datos de filiación de todos los participantes se
emplearon en la identificación inicial, pero no se utilizaron en el análisis
ulterior, que se realizó respetando el anonimato del paciente. Se registró la
edad, el sexo y la fecha de nacimiento, así como la fecha de cada una de las
consultas a las que asistieron.
Los 193 individuos se reclutaron en un periodo de cinco meses y se
incluyó tanto a los pacientes que acudían a primera visita como a visita de
revisión o sucesiva. Todos los sujetos incluidos eran mayores de 18 años,
caucásicos y no emparentados entre sí. La muestra se compuso de 111
pacientes asmáticos y 82 no asmáticos (grupo control).
Los sujetos del grupo control (n=82) se incluyeron una vez aceptaron
participar en el estudio y siempre que cumplieran los siguientes requisitos:
no padecer asma, no ser atópicos y no tener historia de intolerancia a
AINEs.
A todos los pacientes del grupo de asmáticos (n=111) se les hizo una
evaluación y seguimiento en consulta, cada tres meses durante un periodo
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
39
de un año, atendidos siempre por el mismo Facultativo Especialista en
Alergología (Tabla 6).
Tabla 6: Diseño del estudio
1ª VISITA mes 0
2ª VISITA mes 3
3ª VISITA mes 6
4ª VISITA mes 9
5ª VISITA mes 12
Extracción de sangre
para análisis genético
Extracción de sangre
para análisis genético
Revisión
Pruebas de función respiratoria
Ajuste de tratamiento
Clasificación de la gravedad del asma (GEMA)
Se evaluaron una serie de variables que se detallan a continuación.
4.2. Datos clínicos y analíticos
4.2.1. Asma: Los pacientes asmáticos se seleccionaron de entre aquellos
que acudían por primera vez a consultas, y también entre los que
acudían a revisión, con diagnóstico previo de asma o clínica
sugestiva (tos, sibilancias, opresión torácica y/o disnea). En todos
los casos, se verificó la presencia de obstrucción reversible al flujo
aéreo, mediante al menos uno de los siguientes criterios:
• Diferencia mayor o igual al 20% en mediciones del flujo
espiratorio pico (PEF), medido durante al menos dos semanas,
tres mediciones diarias.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
40
• Incremento mayor o igual al 12% del volumen espiratorio forzado
en un segundo (FEV1), con un volumen mínimo de 200 ml, tras la
inhalación de un agonista β2.
• Incremento mayor o igual al 20% del FEV1 tras la administración
de tratamiento con corticoides inhalados, con o sin
broncodilatadores, durante un mes consecutivo.
• Test de metacolina positivo: Descenso de al menos un 20% en el
FEV1, tras la inhalación de dosis crecientes de metacolina.
Se clasificó a los pacientes, según los criterios de gravedad de
la guía GEMA (3), en asma persistente grave, cuando cumplían las
características clínicas expuestas en la Tabla 7. Como es lógico, la
mayoría de los pacientes incluidos ya recibían tratamiento para el
asma y estaban bien controlados. En estos casos, se estableció la
clasificación de gravedad según el escalón terapéutico en que se
encontraban para mantener el control de la enfermedad (137). Se
consideró asma persistente grave cuando se encuadraban en el
escalón terapéutico 5: glucocorticoides inhalados a dosis altas
(budesonida inhalada o equivalente a dosis mayor a 800 µg/día)
asociados a agonista β2 de acción prolongada. Se consideró que se
alcanzaba el control del asma cuando las manifestaciones clínicas
del asma estaban ausentes, o se habían reducido al máximo por las
intervenciones terapéuticas, y se cumplían todos los objetivos del
tratamiento.
Los pacientes asmáticos que no cumplían ninguno de los criterios de
gravedad expuestos, se clasificaron como “asmáticos no graves”.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
41
Tabla 7: Criterios clínicos para Asma Persistente Grave
Síntomas diurnos Síntomas continuos. Varias veces al día
Utilización medicación de rescate
(agonistas β2 de acción corta)
Varias veces al día
Síntomas nocturnos Muchos
Limitación de la actividad Mucha
Función pulmonar (FEV1) % teórico. ≤ 60
Exacerbaciones Dos o más al año
Como ya se ha mencionado, todos los pacientes del grupo de
asmáticos fueron revisados por el mismo facultativo en cinco
ocasiones a lo largo de un año (consultas trimestrales: ver Tabla 6).
Así mismo, en caso de exacerbación de su enfermedad, se les
atendía sin cita previa. En cada una de las visitas programadas
trimestralmente, se evaluaba el control de la enfermedad y se
ajustaban el tratamiento y la clasificación, según criterios de la
GEMA 2009 (3), ya expuestos.
En la quinta y última visita, se clasificó definitivamente a los
pacientes en dos grupos, según los criterios GEMA de gravedad, en
asmáticos con asma persistente grave y cualquier otro escalón de
gravedad:
• Asma persistente grave: n=62
• Asma no grave (intermitente o persistente leve-
moderada): n=49
4.2.2. Atopia: Se consideraron atópicos a aquellos pacientes que
mostraron una o más positividades en las pruebas cutáneas en prick
a aeroalérgenos habituales, realizadas en consulta, y/o la presencia
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
42
de IgE específica positiva a algún alérgeno.
Las pruebas cutáneas en prick se realizaron utilizando una
batería estándar con los aeroalérgenos más comunes en nuestro
medio (ALK-Abelló, Hørsholm, Denmark), y que incluyó:
Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt), Dermatophagoides farinae,
Euroglyphus Maynei, Blomia Tropicalis, Acarus Siro, Tyrophagus
putrescentiae, Lepidoglyphus destructor, Aspergillus fumigatus,
Cladosporium herbarum, Alternaria alternata, Penicillium notatum,
Olea europaea, Lolium perenne, Artemisia vulgaris, látex, mezcla de
plumas, y derivados dérmicos de gato, perro, caballo, cucaracha y
conejo. Se consideraron positivos todos los alérgenos con un
diámetro mayor de la pápula ≥ de 3 mm respecto al control neativo,
transcurridos 15 minutos desde la punción.
Los niveles de IgE total e IgE específica frente a Dpt, se
midieron con el analizador Immulite 2000 (DPC, Los Angeles,
California, USA), a partir suero obtenido de la extracción de sangre
periférica. El punto de corte para la positividad se estableció en
niveles ≥ 0.35 Ku/L para la IgE específica y ≥ 100 Ku/L para la IgE
total.
4.2.3. Prueba de función respiratoria: Se consideró los valores de FEV1
y capacidad vital forzada (FVC) de la espirometría realizada en la
última visita programada. Se utilizó siempre la mejor de tres
maniobras (con un máximo de 8 maniobras). El espirómetro
utilizado a lo largo de todo el periodo de estudio fue un “FlowScreen
spirometer” (Viasys Healthcare, Conshohocken, Pennsylvania, USA).
Se realizaron las calibraciones reglamentarias diarias de este
aparato.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
43
4.2.4. Tolerancia a AINEs: El diagnóstico de Intolerancia a AINEs se
estableció mediante criterios clínicos y de exposición oral
controlada.
En aquellos casos en los que el paciente hubiera presentado
reacción adversa con dos o más AINEs diferentes, el diagnóstico se
consideraba definitivo sin necesidad del test de exposición oral.
En los pacientes con asma grave, o asma no grave pero mal
controlada, no se realizó test de exposición oral en ningún caso.
El diagnóstico no se consideraba definitivo si no se les había
realizado un test de exposición oral controlada con anterioridad, o
no habían tenido reacción adversa con dos o más AINEs.
4.2.5. Resumen: Se recopilaron los siguientes datos de las historias
clínicas:
• Edad.
• Sexo.
• Raza y orígenes.
• Edad de inicio y duración del asma.
• Atopia.
o Pruebas cutáneas en prick frente a batería de
aeroalérgenos.
o Determinación de IgE total.
o Determinación de IgE específica frente a Dpt.
• Función respiratoria: FEV1, FVC.
• Tolerancia AINEs.
• Clasificación según gravedad.
• Tratamiento habitual.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
44
4.3. Determinaciones genéticas
Todas las determinaciones genéticas se llevaron a cabo en la Unidad
de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín.
4.3.1. Extracción de ADN genómico
De cada individuo participante en el estudio se obtuvieron dos
muestras de sangre venosa periférica, que fue procesada según el método
del fenol-cloroformo. Brevemente, el protocolo consiste en aislar y lisar las
células blancas para, a continuación, extraer el ADN mediante una serie de
lavados con fenol/cloroformo y alcohol isoamílico. Con posterioridad, se
precipita el ADN con cloruro sódico e isopropanol y se lava con etanol 70%.
El precipitado obtenido se seca completamente en un concentrador-
evaporador, en vacío y con calor, y se resuspende, una vez seco, en una
solución de Tris y EDTA. Los ADN así obtenidos se midieron por
espectrofotometría para determinar su concentración, ajustándose
posteriormente la misma a 100 ng/µl.
4.3.2. Tipaje del SNP LTC4S -444 A/C
Este SNP se determinó mediante una amplificación génica por la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, seguida de la digestión
del fragmento amplificado con una enzima de restricción específica de
secuencia (PCR-RFLP).
Para la amplificación se utilizaron los siguientes cebadores:
LTC4Sa 5’-TCCATTCTGAAGCCAAAGGC-3’
LTC4Sb 5’-GTCACAGCAGCCAGTAGAGC-3’
Las reacciones se llevaron a cabo con 100 ng de ADN genómico,
desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) a una concentración de 2 mM cada uno,
MgCl2 1,5 mM, dimetil-sulfóxido (DMSO) al 10%, 5 pmol de cada cebador y
0,5 U de polimerasa Taq (Ecogen, Barcelona, España), en un volumen total
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
45
de 25 µL. La PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System
9700 (Applied Biosystems, Foster City, California, EEUU), en las siguientes
condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos; 30 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, alineamiento a 59ºC
durante 30 segundos y elongación a 72ºC durante 1 minuto; extensión final
a 72ºC durante 10 minutos.
La existencia de producto amplificado se comprobó mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio. El
producto de la PCR, un fragmento de 563 pb de longitud fue digerido con la
enzima de restricción MspI, siguiendo las instrucciones del fabricante
(Bioron GmbH, Ludwigshafen, Alemania). Los fragmentos resultantes de la
digestión fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa al
3% y tinción con bromuro de etidio. Los patrones de bandas obtenidos
fueron los esperados: 446 y 117 pb para el alelo A; 446, 85 y 32 pb para el
alelo C.
4.3.3. Tipaje de los polimorfismos ALOX5 -176/-147 y ALOX5AP -
169/-146
Estos polimorfismos se estudiaron simultáneamente mediante una
PCR múltiple y posterior análisis del tamaño de los fragmentos obtenidos.
Los cebadores específicos utilizados fueron los siguientes:
ALOX5a 5’-AGGACCAGACACCTCGCTGAGGAGAGAC-3’
ALOX5b 5’-GAGCAGCGAGCGCCGGGAGCCTCGGC-3’
ALOX5APa 5’-GGGAAGTTTCCCATGAACA-3’
ALOX5APb 5’-ACCATTCTCGACCACGCTGAT-3’
Los cebadores ALOX5a y ALOX5APa estaban marcados con los
fluoróforos 6-FAM y HEX, respectivamente (Applied Biosystems).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
46
La amplificación se realizó en un volumen de 15 µL que contenía 50
ng de DNA genómico, dNTPs 2 mM cada uno, MgCl2 1,5 mM, 4 pmol de
cada cebador y 0,5 U de polimerasa Taq (Ecogen). Las condiciones de la
PCR, llevada a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9700
(Applied Biosystems), fueron las siguientes: desnaturalización a 94ºC
durante 5 minutos; 28 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30
segundos, alineamiento a 58ºC durante 40 segundos y elongación a 72ºC
durante 40 segundos; extensión final a 72ºC durante 10 minutos.
El tamaño de los distintos fragmentos obtenidos de la PCR fue
determinado mediante electroforesis capilar en un secuenciador ABI PRISM
310 (Applied Biosystems) y posterior análisis con el programa GeneScan
v3.1.2. Para el análisis del polimorfismo ALOX5 -176/-147 se produjeron
fragmentos de 255 pb (deleción de 12 pb), 261 pb (deleción de 6 pb), 267
(tipo salvaje) y 273 pb (adición de 6 pb). Para el polimorfismo ALOX5AP -
169/-146 se obtuvieron fragmentos de 357 y 361 pb, que se corresponden
con 19 y 23 repeticiones de adenosina, respectivamente.
4.3.4. Confirmación de secuencias
Algunas muestras con genotipos homocigotos para los polimorfismos
ALOX5 -176/-147 y ALOX5AP -169/-146 fueron secuenciadas, con el fin de
comprobar que los distintos alelos habían sido identificados correctamente.
Para ello se utilizó el kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) y los
mismos cebadores de la PCR. Las muestras fueron sometidas a
electroforesis capilar en un secuenciador ABI PRISM 310 (Applied
Biosystems) y los resultados analizados con el programa DNA Sequencing
Analyser 3.4.1.
4.4. Análisis estadístico
Las desviaciones de la distribución normal se evaluaron mediante la
prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias entre variables
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
47
cuantitativas se estudiaron con la prueba de Mann-Whitney. El equilibrio de
Hardy-Weinberg se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrado.
El efecto de las distintas variantes genéticas en la susceptibilidad a la
enfermedad se determinó como odds ratio (OR), con sus correspondientes
intervalos de confianza del 95% (IC 95%). Un valor de p menor o igual a
0,05 fue considerado significativo. Todos los análisis se llevaron a cabo con
el programa SPSS v13.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
48
5. RESULTADOS
5.1. Datos de la población
Las características generales y clínicas de los individuos participantes
en el estudio se muestran en las Tablas 8, 9 y 10.
Tabla 8. Características demográficas de los individuos participantes en el
estudio.
Asma
persistente
grave
(n=62)
Asma
no grave
(n=49)
Controles
(n=82)
P Prueba
Sexo (H/M) 10/52 10/39 26/56 0,076 χ2
Edad (mediana
(rango))
44 (18-79) 35 (18-72) 30 (18-65) * M-W
Edad de comienzo
(mediana (rango))
16 (0-53) 13 (0-62) 0,169 M-W
Años de evolución
(mediana (rango))
23 (3-63) 20 (4-45) 0,077 M-W
Antecedentes
familiares (n (%))
40 (64,5) 26 (53,1) 0,548 χ2
*Asma grave/Controles, P=0,000; Asma no grave/Controles, P=0,007; Asma grave/Asma no
grave, P=0,002.
Los pacientes del estudio fueron mayoritariamente mujeres (82%),
aunque la proporción de ambos sexos fue equivalente en los tres grupos. La
edad media difirió significativamente, siendo mayor en el grupo de
asmáticos graves que en el de asmáticos no graves y mayor en cualquier
grupo de asmáticos comparado con los controles.
La edad de comienzo del asma, así como los años de evolución de la
enfermedad, son ligeramente mayores en los asmáticos graves, sin que
existan diferencias significativas.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
49
Los antecedentes familiares, entendidos como tener diagnóstico de
asma en padres y/o abuelos, entre los pacientes asmáticos incluidos en el
estudio, fueron similares.
Tabla 9. Características específicas de alergia y reflujo gastroesofágico
(RGE) de los individuos participantes en el estudio.
Asma
persistente
grave
(n=62)
Asma
no grave
(n=49)
P Prueba
Pruebas alérgica positivas frente
a aeroalérgenos (n (%))
43 (69,4) 46 (93,9) 0,001 χ2
IgE total en Ku/L (mediana
(rango))
159 (0-2000) 196 (0-
2000)
0,785 M-W
IgE Dpt> 0,35 ku/L (n (%)) 35/56 (56,5) 36/44 (73,5) 0,035 χ2
Intolerancia AINES (n (%)) 6 (9,7) 7 (14,3) 0,556 χ2
Rinitis (n (%)) 61 (98,4) 49 (100) 1,000 χ2
RGE (n (%)) 25 (40,3) 28 (57,1) 0,088 χ2
El porcentaje de sujetos con pruebas cutáneas en prick positivas
frente a uno o más de los aeroalérgenos más habituales en nuestro medio,
fue significativamente más elevado en el grupo de asma no grave,
comparado con el grupo de asma grave. Destaca que, la presencia de
pruebas alérgicas en prick test positivas entre los pacientes con asma no
grave fue del 94%, frente a un 69% en los asmáticos graves. En relación
directa con estos hallazgos, la IgE específica frente a Dpt (alérgeno más
prevalente de nuestro área) estaba elevada con más frecuencia en los
pacientes con asma no grave. Sin embargo, no se detectaron diferencias
significativas con respecto a los niveles de IgE total.
La intolerancia a AINEs, la presencia de rinitis y/o de RGE tampoco
mostraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
50
Tabla 10. Características de función respiratoria y tratamiento de los
individuos participantes en el estudio.
Asma persistente
grave
(n=62)
Asma
no grave
(n=49)
P Prueba
% FVC (media (± DE)) 70 (34-89) 85 (54-130) 0,000 M-W
% FEV1 (media (±
DE))
70 (32-93) 88 (44-117) 0,000 M-W
β2 corta (n (%)) 48 (77,4) 27 (55,1) 0,015 χ2
β2 larga (n (%)) 62 (100) 34 (69,4) 0,000 χ2
Anti-LT (n (%)) 53 (85,5) 10 (20,4) 0,000 χ2
Xantina (n (%)) 6 (9,7) 0 (0) 0,033 χ2
Anticolinérgicos (n
(%))
13 (21,0) 0 (0) 0,000 χ2
CS inhalados (n (%)) 62 (100) 36 (73,5) 0,000 χ2
Los parámetros de función respiratoria (FEV1 y FVC) estaban
significativamente descendidos en los pacientes con asma persistente grave
(Tabla 10). Del mismo modo, la medicación necesaria fue muy superior en
el grupo de asma persistente grave.
Estas diferencias observadas entre los distintos grupos de gravedad
del asma, tanto en los parámetros de función respiratoria como en los
requerimientos de fármacos y las posologías prescritas, son las esperadas,
puesto que la inclusión de los pacientes en las diferentes escalas de
gravedad del asma, dependía directamente de estas características.
Estratificando a los pacientes por sexo, las diferencias que se
aprecian entre los grupos de asmáticos, son superponibles a las expuestas
para el total de la población: las mujeres con asma grave son mayores que
las pacientes con asma no grave, y hay una prevalencia de atopia
significativamente mayor en el grupo de pacientes con asma no grave
(Tabla 11).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
51
Tabla 11. Características de las mujeres incluidas en el estudio.
MUJERES
Asma
grave
(n=52)
Asma no
grave
(n=39)
P Prueba
Edad (mediana (rango)) 44,5 (20-
79)
36,0 (18-72) 0,005 M-W
Mayores de 50 años (n (%)) 22 (42,3) 10 (10,3) 0,001 χ2
Edad de comienzo (mediana
(rango))
16 (0-53) 14 (0-62) 0,245 M-W
Años de evolución (mediana
(rango))
23 (5-54) 20 (5-45) 0,107 M-W
Atopia (n (%)) 34 (65,4) 37 (94,9) 0,001 χ2
Intolerancia AINES (n (%)) 6 (11,5) 5 (12,8) 0,550 χ2
β2 corta (n (%)) 43 (82,7) 24 (61,6) 0,022 χ2
Anti-LT (n (%)) 43 (82,7) 6 (15,4) 0,000 χ2
Entre los varones, se encuentra relaciones no significativas en la
mayoría de las variables, probablemente debido al bajo número de
pacientes, hombres, incluidos (Tabla 12).
Comparando el total de pacientes agrupados por sexo, no se obtuvo
diferencias respecto a la gravedad del asma, la edad, ni la presencia de
atopia (Tabla 13). Por lo tanto, existía homogeneidad entre ambos sexos.
Destaca que el número de mujeres incluidas en el estudio es
considerablemente mayor al de varones (cuatro veces superior),
característica común con otros trabajos similares.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
52
Tabla 12. Características de los varones incluidos en el estudio.
VARONES
Asma
grave
(n=10)
Asma no
grave
(n=10)
P Prueba
Edad (mediana (rango)) 38,5 (18-
66)
32,5 (18-54) 0,089 M-W
Mayores de 50 años (n (%)) 3 (30,0) 1 (10,0) 0,582 χ2
Edad de comienzo (mediana
(rango))
16 (2-40) 7 (0-40) 0,425 M-W
Años de evolución (mediana
(rango))
24,5 (3-63) 23 (4-40) 0,545 M-W
Atopia (n (%)) 9 (90,0) 9 (90,0) 0,763 χ2
Intolerancia AINES (n (%)) 0 (0) 2 (20,0) 0,237 χ2
β2 corta (n (%)) 5 (50,0) 3 (30,0) 0,325 χ2
Anti-LT (n (%)) 10 (100) 4 (40,0) 0,005 χ2
Tabla 13. Comparación del total de pacientes, agrupados por sexo.
Hombres
(n=20)
Mujeres
(n=91)
P Prueba
Edad (mediana (rango)) 35 (18-66) 42 (18-79) 0,277 M-W
Asma persistente grave 10 (50%) 52 (57%) 0,564 χ2
Asma no grave 10 (50%) 39 (43%) 0,532 χ2
Mayores de 50 años (n (%)) 4 (20,0) 26 (28,6) 0,434 χ2
Edad de comienzo (mediana (rango)) 10,5 (0-40) 15 (0-62) 0,291 M-W
Años de evolución (mediana (rango)) 24,5 (3-63) 22,5 (5-54) 0,985 M-W
Atopia (n (%)) 18 (90,0) 71 (78,0) 0,185 χ2
Rinitis (n (%)) 20 (100) 90 (98,9) 0,820 χ2
Intolerancia AINES (n (%)) 2 (10,0) 11 (12,1) 0,573 χ2
Anti-LT (n (%)) 14 (70,0) 49 (53,8) 0,142 χ2
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
53
En la Tabla 14 se muestran los resultados obtenidos al comparar
todos los pacientes asmáticos con pruebas cutáneas en prick positivas y/o
IgE específica frente a Dpt elevada (asma extrínseco), frente a aquellos con
ambas pruebas negativas (asma intrínseco), es decir, se compara a los
pacientes considerando la variable “atopia”.
Se observaron diferencias significativas en las pruebas cutáneas a
aeroalergenos y en la IgE específica, según lo esperado en base al criterio
de selección. La IgE total también estaba significativamente más elevada en
el grupo de pacientes con asma extrínseco.
Se encontraron diferencias significativas en la edad media de la
enfermedad siendo, como cabía esperar, mayor en pacientes con asma
intrínseca; así, la edad de comienzo del asma prácticamente se duplicaba
en los pacientes con asma intrínseca. Entre los mayores de 50 años, se
encontró una mayor presencia de mujeres que tuvieran asma intrínseca
frente a los varones y, de hecho, un total del 60% de todas las asmas
intrínsecas eran mujeres con más de 50 años de edad. Por otro lado, en
nuestro estudio, ningún varón con más de 50 años había sido diagnosticado
de asma intrínseca. No había diferencias respecto a los años de evolución, a
pesar de que el asma intrínseca era más frecuente en mayores,
probablemente debido a que esta enfermedad comienza en etapas más
tardías de la vida, comparado con el asma extrínseco
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
54
Tabla 14. Comparación de los pacientes con asma intrínseca y asma
extrínseca.
Asma
intrínseca
(n=22)
Asma
extrínseca
(n=89)
P Prueba
Sexo (H/M) 2/20 18/71 0,354 χ2
Edad (mediana (rango)) 55,0 (27-79) 36,0 (18-72) 0,000 M-W
Asma persistente grave(n (%)) 19 (86) 43 (48) 0,000 χ2
Asma no grave (n (%)) 3 (14) 46 (52) 0,000 χ2
Hombres mayores de 50 años (n
(%))
0 (0) 4 (4,5) 0,000 χ2
Mujeres mayores de 50 años (n
(%))
13 (60) 13 (14,6) 0,000 χ2
Edad de comienzo (mediana
(rango))
25 (2-53) 13 (0-62) 0,002 M-W
Años de evolución (mediana
(rango))
25 (7-54) 23 (3-63) 0,424 M-W
Ku/L IgE total (mediana (rango)) 51 (0-202) 108 (0-2000) 0,000 M-W
IgE Dpt> 0,35 kU/L (n (%)) 0 (0) 71 (79,8) 0,000 χ2
β2 corta (n (%)) 17 (77,3) 58 (65,2) 0,320 χ2
β2 larga (n (%)) 21 (95,5) 75 (84,3) 0,152 χ2
Anti-LT (n (%)) 18 (81,8) 45 (50,6) 0,007 χ2
Xantina (n (%)) 5 (22,7) 1 (1,1) 0,001 χ2
Anticolinérgicos (n (%)) 5 (22,7) 8 (9,0) 0,130 χ2
CS inhalados (n (%)) 22 (100) 76 (85,4) 0,068 χ2
En el estudio, había un número mayor de asmas intrínsecas en
tratamiento con anti-LT y teofilinas, en comparación con los otros grupos.
Ello es consecuencia de la mayor demanda de medicación entre los asmas
más graves, y reafirma la vinculación directa entre asma intrínseca y
gravedad del asma.
Un 86% del total de pacientes con asma intrínseco padecían asma
persistente grave. Expuesto a la inversa: solo 3 de los 22 pacientes con
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
55
asma intrínseco (14%) no tienen asma persistente grave, frente a un 52%
de los pacientes con asma extrínseco. El perfil de pacientes más
característico en el grupo de asma intrínseco y persistente grave era: mujer
mayor de 50 años, que debutó con asma en la edad adulta y lo padecía
desde hacía aproximadamente 25 años.
Se ha asociado con frecuencia la intolerancia a AINEs con el asma
intrínseca y con la gravedad del asma. Sin embargo, la distribución de la
intolerancia a AINEs entre los pacientes asmáticos de nuestra población era
perfectamente homogénea.
No se encontró relación entre la presencia de intolerancia a AINEs y
la atopia (asma extrínseca-asma intrínseca) (Tabla 15). Tampoco se obtuvo
asociación entre intolerancia a AINEs y la gravedad del asma (Tabla 16).
Tabla 15. Relación entre atopia e intolerancia a AINEs.
Asma
intrínseca
(n=22)
Asma
extrínseca
(n=89)
P Prueba
Intolerancia AINES (n
(%))
2 (9,1) 11 (12,4) 1,000 χ2
Tabla 16. Relación entre la gravedad del asma y la intolerancia a AINEs.
Asma persistente
grave
(n=62)
Asma
no grave
(n=49)
P Prueba
Intolerancia AINES (n (%)) 6 (9,7) 7 (14,3) 0,556 χ2
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
56
5.2. Polimorfismos de la vía de la 5-LO
El análisis del equilibrio de Hardy-Weimberg se cumplía en nuestra
población para los tres polimorfismos estudiados (P=0,508, 0,330 y 0,144
para LTC4S −444 A/C, ALOX5 −176/−147 y ALOX5AP −169/−146,
respectivamente).
Las frecuencias alélicas se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17. Frecuencias alélicas.
Polimorfismo Alelo Asma grave Asma no grave Controles
A 0.75 0.80 0.75 LTC4S -444A/C
C 0.25 0.20 0.25
6* 0.02 0.03 0.01
5 0.78 0.69 0.71
4 0.18 0.23 0.26 ALOX5 -147/-176
3 0.02 0.05 0.02
361† 0.84 0.80 0.81 ALOX5AP -169/-
146 357 0.16 0.20 0.19 *Número de sitios de unión para Sp1/Egr1. †pb.
Los genotipos encontrados en nuestra población se detallan en la
Tabla 18.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
57
Tabla 18. Frecuencia de genotipos.
Polimorfismo Genotipo Asma grave Asma no grave Controles
AA 0.56 0.63 0.55
AC 0.39 0.33 0.40 LTC4S -444A/C
CC 0.5 0.4 0.5
5/5 0.68 0.51 0.55
5/- 0.21 0.37 0.32 ALOX5 -147/-176
-/- 0.11 0.12 0.13
361/361 0.77 0.63 0.68
361/357 0.15 0.33 0.26 ALOX5AP -169/-146
357/357 0.8 0.4 0.6
5.2.1. Análisis de genotipos
La posible asociación de los genotipos con la enfermedad, se estudió
utilizando cuatro tipos de modelos de herencia (codominante, dominante,
recesivo y aditivo). Se analizaron, comparando con controles, el total de los
pacientes con asma en su conjunto y, separadamente, los controles con los
dos grupos de gravedad de asma. Estos análisis miden el riesgo de padecer
asma según los distintos polimorfismos y modelos de herencia.
Se analizan también estas las diferencias genéticas bajo los distintos
modelos de herencia en los dos grupos de asmáticos, comparándolos entre
si, para valorar el riesgo de padecer asma de mayor gravedad, cuando ya
se tiene el diagnóstico de asma (Tablas 19-30).
Las tablas de riesgo para los distintos polimorfismos y modelos de
herencia se exponen a continuación con el orden siguiente:
Polimorfismos del LTC4S -444A/C:
• Tabla 19: Controles – Asma persistente grave.
• Tabla 20: Controles – Asma no grave.
• Tabla 21: Total asmáticos - Controles.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
58
• Tabla 22: Asma no grave – asma persistente grave.
Polimorfismos del ALOX5 −176/−147:
• Tabla 23: Controles – Asma persistente grave.
• Tabla 24: Controles – Asma no grave.
• Tabla 25: Total asmáticos - Controles
• Tabla 26: Asma no grave – asma persistente grave.
Polimorfismo ALOX5AP −169/−146:
• Tabla 27: Controles – Asma persistente grave.
• Tabla 28: Controles – Asma no grave.
• Tabla 29: Total asmáticos - Controles
• Tabla 30: Asma no grave – asma persistente grave.
Efecto interacción de los polimorfismos LTC4S –444 A/C, ALOX5 –
176/–147, y ALOX5AP –169/–146:
• Tabla 31
5.2.1.1. LTC4S
Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre controles y pacientes
con asma persistente grave (Tabla 19), bajo los cuatro modelos de herencia
posibles, no se encontró ningún SNP que incrementara el riesgo de padecer
asma persistente grave. Tampoco se encontró ningún SNP con efecto
protector frente al desarrollo de asma persistente grave.
Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre controles y pacientes
con asma no persistente grave (Tabla 20), no se encontró ningún SNP que
incrementara el riesgo de padecer asma bajo ninguno de los cuatro modelos
de herencia; así mismo, no se encontró ningún SNP con efecto protector
frente al desarrollo de asma.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
59
Tabla 19: Análisis de riesgo del SNP LTC4S −444 A/C en función del modelo
de herencia: controles con asma persistente grave.
LTC4S: Controles / Asma persistente grave
Modeloa Genotipo Controles Asma p. grave OR (IC 95%)
n % n %
Co AA 45 54,9 34 55,7 1
AC 33 40,2 24 39,3 0,96 (0,48-1,92)
CC 4 4,9 3 4,9 0,99 (0,21-4,73)
Re AA-AC 78 95,1 58 95,1 1
CC 4 4,9 3 4,9 1,01 (0,22-4,68)
Do AA 45 54,9 34 55,7 1
AC-CC 37 45,1 27 44,3 0,97 (0,50-1,88)
Ad 0.97 (0,56-1,71) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Tabla 20: Análisis de riesgo del SNP LTC4S −444 A/C en función del modelo
de herencia: controles con asma no persistente grave.
LTC4S: Controles / Asma no grave
Modeloa Genotipo Controles Asma no grave OR (IC 95%)
n % n %
Co AA 45 54,9 31 63,3 1
AC 33 40,2 16 32,7 0,70 (0,33-1,49)
CC 4 4,9 2 4,1 0,73 (0,12-4,21)
Re AA-AC 78 95,1 47 95,9 1
CC 4 4,9 2 4,1 0,83 (0,15-4,70)
Do AA 45 54,9 31 63,3 1
AC-CC 37 45,1 18 36,7 0,71 (0,34-1,46)
Ad 0,76 (0,41-1,41) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
60
Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre controles y el total de
pacientes con asma, sin diferenciarlos según gravedad, se reprodujeron los
resultados de los dos supuestos anteriores, en los que se analizaban por
separado a los pacientes con asma persistente grave y no grave con los
controles. No se encontró ningún SNP que aumentara o disminuyera el
riesgo de padecer asma bajo ninguno de los cuatro modelos de herencia
(Tabla 21).
Tabla 21: Análisis de riesgo del SNP LTC4S−444 A/C en función del modelo
de herencia: controles con total de pacientes asmáticos.
LTC4S: Total asmáticos / Controles
Modeloa Genotipo Total asmáticos Controles OR (IC 95%)
n % n %
Co AA 65 59,1 45 54,9 1
AC 40 36,4 33 40,2 0,84 (0,46-1,52)
CC 5 4,5 4 4,9 0,86 (0,22-3,40)
Re AA-AC 105 95,5 78 95,1 1
CC 5 4,5 4 4,9 1,08 (0,28-4,14)
Do AA 65 59,1 45 54,9 1
AC-CC 45 40,9 37 45,1 0,84 (0,47-1,50)
Ad 0,88 (0,54-1,43) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Al comparar los SNPs del LTC4S -444A/C entre los distintos grupos de
gravedad del asma (pacientes con asma persistente grave con los pacientes
asmáticos no graves), no se encontró ningún SNP que incrementara el
riesgo de padecer asma más grave entre los pacientes asmáticos, bajo
ninguno de los cuatro modelos de herencia. Tampoco se encontró ningún
SNP protector frente al riesgo de padecer asma de mayor gravedad (Tabla
22).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
61
Tabla 22: Análisis de riesgo del SNP LTC4S−444 A/C en función del modelo
de herencia: pacientes con asma no persistente grave comparado con asma
persistente grave.
LTC4S: Asma no grave / Asma persistente grave
Modeloa Genotipo Asma no grave Asma p grave OR (IC 95%)
n % n %
Co AA 31 63,3 34 55,7 1
AC 16 32,7 24 39,3 1,37 (0,62-3,04)
CC 2 4,1 3 4,9 1,37 (0,21-8,73)
Re AA-AC 47 95,9 58 95,1 1
CC 2 4,1 3 4,9 1,22 (0,19-7,58)
Do AA 31 63,3 34 55,7 1
AC-CC 18 36,7 27 44,3 1,37 (0,63-2,95)
Ad 1,28 (0,67-2,47) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
5.2.1.2. ALOX5
Se analizaron los polimorfismos de adicción o delección de
repeticiones en tándem “GGGCGC” en la región promotora de ALOX5,
motivos de reconocimiento para Sp1/Erg-1. Se consideró como normal la
variante más común de cinco repeticiones en tándem (“5”) y como
mutación (“Mut”) cualquier número de repeticiones diferente de cinco.
Al comparar el grupo control con los pacientes con asma persistente
grave (Tabla 23) bajo los cuatro modelos de herencia posibles, no se
identificó ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de padecer asma
persistente grave. Tampoco se encontró ninguna mutación protectora para
el desarrollo de asma persistente grave.
Utilizando el modelo de herencia codominante, parecía existir cierta
relación (sin significación estadística) entre el genotipo heterocigoto y un
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
62
menor riesgo de padecer asma persistente grave. Este hallazgo no se
reproduce en los otros modelos de herencia.
Tabla 23. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5 −176/−147 en función
del modelo de herencia: controles con asma persistente grave.
ALOX5: Controles / Asma persistente grave
Modeloa Genotipo Controles Asma p. grave OR (IC 95%)
n % n %
Co 55 45 54,9 42 67,7 1
5- 26 31,7 13 21,0 0,54 (0,24-1,18)
Mut 11 13,4 7 11,3 0,68 (0,24-1,92)
Re 55/5- 71 86,6 55 88,7 1
Mut 11 13,4 7 11,3 0,82 (0,30-2,56)
Do 55 45 54,9 42 67,7 1
5-/Mut 37 45,1 20 32,3 0,58 (0,29-1,52)
Ad 0,73 (0,45-1,19) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Al comparar el número de repeticiones en tándem en la región
promotora de ALOX5 entre el grupo control y los pacientes con asma no
persistente grave (Tabla 24), no se halló ninguna mutación que
incrementara el riesgo de padecer asma, bajo ninguno de los cuatro
modelos de herencia. Así mismo, no se encontró ningún polimorfismo
protector frente al asma, bajo ninguno de los cuatro modelos de herencia.
Al comparar el número de repeticiones en tándem en la región
promotora de ALOX5 entre controles y el total de pacientes asmáticos, sin
hacer distinciones según la gravedad de la enfermedad, no se encontró
ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de padecer asma, bajo
ninguno de los cuatro modelos de herencia. Así mismo, no se halló ningún
polimorfismo protector frente al asma, bajo ninguno de los cuatro modelos
de herencia (Tabla 25).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
63
Tabla 24. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5 −176/−147 en función
del modelo de herencia: controles con asma no grave.
ALOX5: Controles / Asma no grave
Modeloa Genotipo Controles Asma no grave OR (IC 95%)
n % n %
Co 55 45 54,9 25 51,0 1
5- 26 31,7 18 36,7 1,25 (0,57-2,70)
Mut 11 13,4 6 12,2 0,98 (0,32-2,97)
Re 55/5- 71 86,6 43 87,8 1
Mut 11 13,4 6 12,2 0,90 (0,31-2,61)
Do 55 45 54,9 25 51,0 1
5-/Mut 37 45,1 24 49,0 1,17 (0,57-2,37)
Ad 1,05 (0,64-1,74) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Tabla 25. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5 −176/−147 en función
del modelo de herencia: asmáticos totales con controles.
ALOX5: Total asmáticos / Controles
Modeloa Genotipo Total asmáticos Controles OR (IC 95%)
n % n %
Co 55 67 60,4 45 54,9 1
5- 31 27,9 26 31,7 0,80 (0,42-1,52)
Mut 13 11,7 11 13,4 0,79 (0,33-1,99)
Re 55/5- 98 88,3 71 86,6 1
Mut 13 11,7 11 13,4 0,86 (0,36-2,02)
Do 55 67 60,4 45 54,9 1
5-/Mut 44 39,6 37 45,1 0,80 (0,49-1,42)
Ad 0,87 (0,58-1,30) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
64
Al comparar el número de repeticiones en tándem en la región
promotora de ALOX5 entre los distintos grupos de gravedad del asma
(pacientes con asma persistente grave con los pacientes asmáticos no
graves), no se identificó ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de
padecer asma más grave entre los pacientes asmáticos en ninguno de los
cuatro modelos de herencia. Así mismo, no se halló ningún polimorfismo
con efecto protector frente al riesgo de padecer asma de mayor gravedad
(Tabla 26).
Tabla 26. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5 −176/−147 en función
del modelo de herencia: asma no grave comparado con asma persistente
grave.
ALOX5: Asma no grave / Asma persistente grave
Modeloa Genotipo Asma no grave Asma grave OR (IC 95%)
n % n %
Co 55 25 51,0 42 67,7 1
5- 18 36,7 13 21,0 0,43 (0,18-1,02)
Mut 6 12,2 7 11,3 0,69 (0,21-2,30)
Re 55/5- 43 87,8 55 88,7 1
Mut 6 12,2 7 11,3 0,91 (0,29-2,91)
Do 55 25 51,0 42 67,7 1
5-/Mut 24 49,0 20 32,3 0,50 (0,23-1,07)
Ad 0,69 (0,40-1,19) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
5.2.1.3. ALOX5AP
Se analizó el polimorfismo de la región promotora de ALOX5AP -169/-
146. Se realizó PCR múltiple y posterior análisis de los fragmentos
resultantes, obteniendo fragmentos de 357 y 361 pb, que se correspondían
con 19 y 23 repeticiones de adenosina, respectivamente. Veintitrés
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
65
repeticiones (361 pb) era el polimorfismo más frecuente, y se consideró
como mutación los fragmentos de 357 pb con diecinueve repeticiones de
adenosina.
Comparando a los sujetos del grupo control con los pacientes
con asma persistente grave (Tabla 27), bajo los cuatro modelos de herencia
posibles, no se encontró ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de
padecer asma persistente grave. Tampoco se halló ningún polimorfismo que
fuera protector frente al desarrollo de asma persistente grave.
Tabla 27. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5AP −169/−146 en
función del modelo de herencia: controles con asma persistente grave.
ALOX5AP: Controles / Asma persistente grave
Modeloa Genotipo Controles Asma p. grave OR (IC 95%)
n % n %
Co 361-361 55 67,9 47 77,0 1
361-357 21 25,9 9 14,8 0,50 (0,21-1,20)
357-357 5 6,2 5 8,2 1,17 (0,32-4,29)
Re Por. 361 76 93,8 56 91,8 1
357-357 5 6,2 5 8,2 1,36 (0,37-4,91)
Do 361-361 55 67,9 47 77,0 1
Por. 357 26 32,1 14 23,0 0,63 (0,29-1,34)
Ad 0,82 (0,47-1,43)
aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Al comparar el grupo control con los pacientes con asma no grave
(Tabla 28), bajo los cuatro modelos de herencia posibles, no se identificó
ningún polimorfismo que incrementara el riesgo de padecer asma no grave
ni tampoco polimorfismos con acción protectora frente al asma no
persistente grave.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
66
Tabla 28. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5AP −169/−146 en
función del modelo de herencia: controles con asma no grave.
ALOX5AP: Controles / Asma no grave
Modeloa Genotipo Controles Asma no grave OR (IC 95%)
n % n %
Co 361-361 55 67,9 31 63,3 1
361-357 21 25,9 16 32,7 1,35 (0,62-2,97)
357-357 5 6,2 2 4,1 0,71 (0,13-3,88)
Re Por. 361 76 93,8 47 95,9 1
357-357 5 6,2 2 4,1 0,65 (0,12-3,47)
Do 361-361 55 67,9 31 63,3 1
Por. 357 26 32,1 18 36,7 1,23 (0,58-2,59)
Ad 1,08 (0,59-1,96)
aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Al comparar el número de repeticiones de adenosina en la región
promotora de ALOX5AP entre controles y el total de pacientes asmáticos,
sin distinciones según la gravedad de la enfermedad, tampoco se encontró
ningún polimorfismo que aumentara el riesgo de padecer asma, bajo
ninguno de los cuatro modelos de herencia. Así mismo, no se encontró
ningún polimorfismo que protegiera frente al desarrollo de asma, bajo
ninguno de los cuatro modelos de herencia (Tabla 29).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
67
Tabla 29. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5AP −169/−146 en
función del modelo de herencia: total de asmáticos con controles.
ALOX5AP: Total asmáticos / Controles
Modeloa Genotipo Total asmáticos Controles OR (IC 95%)
n % n %
Co 361-361 78 70,9 55 67,9 1
361-357 25 22,7 21 25,9 0,84 (0,43-1,65)
357-357 7 6,4 5 6,2 0,99 (0,30-3,27)
Re Por. 361 103 93,6 76 93,8 1
357-357 7 6,4 5 6,2 1,03 (0,32-3,39)
Do 361-361 78 70,9 55 67,9 1
Por. 357 32 29,1 26 32,1 0,87 (0,47-1,62)
Ad 0,92 (0,57-1,49) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
Al comparar el número de repeticiones de adenosina en la región
promotora de ALOX5AP, entre los distintos grupos de gravedad del asma
(pacientes con asma persistente grave con los pacientes asmáticos no
graves), no se encontró ningún polimorfismo que incrementara el riesgo de
padecer asma más grave entre los pacientes asmáticos, en ninguno de los
cuatro modelos de herencia.
El único resultado estadísticamente significativo que se encontró fue
un menor OR para el genotipo heterocigoto 361/357 del polimorfismo
ALOX5AP -169/-146, con respecto al homocigoto 361/361, comparando
asma no persistente grave con los que si la tenían. Este polimorfismo
“protector para asma persistente grave” se apreció sólo en el modelo de
herencia codominante y no se reprodujo en homocigotos 357/357, ni
tampoco bajo la hipótesis de que el alelo 357 se heredara con carácter
dominante o recesivo (Tabla 30).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
68
Tabla 30. Análisis de riesgo del polimorfismo ALOX5AP −169/−146 en
función del modelo de herencia: asma no grave con asma persistente grave.
ALOX5AP: Asma no grave / Asma persistente grave
Modeloa Genotipo Asma no grave Asma p grave OR (IC 95%)
n % n %
Co 361-361 31 63,3 47 77,0 1
361-357 16 32,7 9 14,8 0,37 (0,15-0,94)
357-357 2 4,1 5 8,2 1,65 (0,30-9,04)
Re Por. 361 47 95,9 56 91,8 1
357-357 2 4,1 5 8,2 1,22 (0,19-7,58)
Do 361-361 31 63,3 47 77,0 1
Por. 357 18 36,7 14 23,0 0,51 (0,22-1,18)
Ad 0,76 (0,41-1,43) aModelos de herencia: Codominante (Co), Recesivo (Re), Dominante (Do), Aditivo
(Ad)
5.2.1.4. Análisis conjunto de los polimorfismos
Se realizó también una prueba que tenía como objetivo detectar un
posible efecto de interacción entre los tres genes, es decir, una asociación
de la enfermedad con la presencia de alelos de riesgo de cualquiera de los
polimorfismos estudiados (Tabla 31).
Consideramos como alelos de riesgo los siguientes:
• El alelo C del polimorfismo LTC4S −444 A/C.
• El alelo que determinaba un número de sitios de unión Sp1/Egr1
distinto de 5 en ALOX5 −176/−147.
• El alelo de 357 pb (19 repeticiones de adenosina) del ALOX5AP
−169/−146.
Con el fin de aumentar el poder estadístico, los alelos de riesgo se
organizaron en categorías según la cantidad de cada uno que presentaba
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
69
cada individuo (ninguno, uno, dos, o más de dos), considerando los tres
polimorfismos en conjunto.
No se observó ninguna asociación con la enfermedad, ni siquiera en
aquellos pacientes que presentaban más de dos polimorfismos
considerados, según bibliografía, de riesgo para asma.
Tabla 31. Efecto interacción de los polimorfismos LTC4S –444 A/C, ALOX5
–176/–147, y ALOX5AP –169/–146.
Nº de alelos de riesgo AG
ANG
Controles
Total
0 17 (28.3%) 10 (20.4%) 19 (23.5%) 46 (24.2%)
1 23 (38.3%) 17 (34.7%) 23 (28.4%) 63 (33.2%)
2 13 (21.7%) 15 (30.6%) 29 (35.8%) 57 (30.0%)
Más de 2 7 (11.7%) 7 (14.3%) 10 (12.3%) 24 (12.6%)
Total 60 (100%) 49 (100%) 81 (100%) 190 (100%)
AG: Asma persistente grave; ANG: Asma no persistente grave.
5.3. Intolerancia a AINEs- gravedad del asma
Al analizar la asociación de la intolerancia a AINEs con la gravedad
del asma, y la de los distintos polimorfismos con la gravedad del asma,
separados según tuvieran o no intolerancia a AINEs, no se apreció relación
en ninguno de los supuestos. El número de pacientes con intolerancia a
AINEs era, sin embargo, muy reducido.
a) Al analizar la asociación de la intolerancia a AINEs con la gravedad
del asma, no se encontró asociación entre la gravedad del asma y la
intolerancia a AINEs: test χ2; p=0,556 (Tabla 32).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
70
b) El estudio de la asociación entre los distintos polimorfismos y la
gravedad del asma, considerando solo los pacientes asmáticos con
buena tolerancia a AINEs (n=98):
p= 0,474 para los SNPs de LTC4S.
p= 0,066 para los polimorfismos de ALOX5. Existía asociación
no estadísticamente significativa.
p= 0,087 para los polimorfismos de ALOX5AP.
c) El análisis de la asociación entre los distintos polimorfismos y la
gravedad del asma, considerando solo los pacientes asmáticos con
intolerancia a AINEs (n=13):
p= 0,592 para los SNPs de LTC4S.
p= 0,632 para los polimorfismos de ALOX5.
p= 0,529 para los polimorfismos de ALOX5AP.
Tabla 32. Asociación de la intolerancia a AINEs con la
gravedad del asma.
AG ANG Total
No 56 42 98 AINEs Si 6 7 13
62 49 111
AG: Asma persistente grave, ANG: Asma no persistente grave.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
71
6. DISCUSION
Desde una perspectiva conservadora, se ha estimado que el asma
afecta a más de 300 millones de personas en el mundo. Teniendo en cuenta
la previsión de crecimiento poblacional y el mayor grado de urbanización, se
calcula que, en unos diez años, esta cifra se vea incrementada en otros 100
millones de personas (138). El número total de exacerbaciones que
requieren asistencia urgente, así como el gasto sanitario derivado del asma,
han aumentado en paralelo, reflejando un incremento importante en el
número de casos de asma persistente grave (139). Se ha estimado, así
mismo, que alrededor de 255.000 personas mueren cada año como
resultado de complicaciones del asma (140).
En los comienzos del siglo XXI, la carga sanitaria que genera el asma
es de suficiente magnitud como para que muchos gobiernos reconozcan la
prioridad de elaborar estrategias para la prevención y control de esta
enfermedad. La identificación de marcadores genéticos con capacidad de
determinar qué pacientes tienen un mayor riesgo de padecer la
enfermedad, o de que ésta sea más grave, supondría un importante avance
en materia de prevención. De hecho, las principales aportaciones de los
estudios genéticos sobre asma se pueden resumir en cuatro puntos (141):
1) Conocimiento más profundo de la patogenia, permitiendo la
caracterización de nuevos genes y vías capaces de conducir a nuevas
dianas terapéuticas.
2) Identificación de los factores ambientales susceptibles de
interaccionar con la base genética individual y, al mismo tiempo,
confirmar el papel etiológico de los factores ambientales. Ello permite
la prevención de la enfermedad mediante la actuación sobre el medio
ambiente.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
72
3) Tipificación de individuos susceptibles de padecer formas graves de
asma. Gracias a la detección precoz se puede diseñar e implementar
terapias preventivas en los sujetos de riesgo.
4) Diseño de tratamientos específicos de los pacientes:
a. Subclasificación de la enfermedad sobre las bases genéticas y
diseño de tratamientos basados en dicha clasificación.
b. Identificación de sujetos con riesgo de enfermedad grave y
diseño de tratamientos preventivos.
c. Determinación de la probabilidad de que un paciente responda
a un tratamiento concreto.
El asma es una enfermedad crónica caracterizada por inflamación de
la mucosa de la vía respiratoria y broncoconstricción, que cursa de forma
característica con disnea, sibilancias, opresión torácica y/o tos. Los motivos
por los que solo determinados individuos padecen asma no están aclarados,
sin embargo, existe consenso en que el asma es el resultado de una
combinación de factores genéticos y ambientales. Así, se han identificado
un gran número de variaciones genéticas en estudios de asociación y
GWAS. Algunas de estas variantes genéticas se han propuesto como
marcadores de la enfermedad, mientras que con otras no se ha encontrado
ninguna asociación.
La aportación de los estudios de asociación genética en el asma es
fundamental para dilucidar dudas y ampliar conocimientos sobre esta
enfermedad. Los trabajos cuyos resultados no establecen ninguna
asociación aportan, a pesar de ello, información de relevancia comparable a
aquellos que sí la presentan. La trascendencia de estos trabajos es aún
mayor cuando se analizan conjuntamente los resultados de varios proyectos
de investigación. El elevado coste de los estudios de polimorfismos implica,
frecuentemente, la inclusión de un número de pacientes menor del deseado
para obtener resultados estadísticamente significativos. El análisis
combinado de los resultados de diferentes estudios de asociación genética,
realizados en poblaciones similares o dispares étnicamente, se perfila como
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
73
la mejor alternativa para alcanzar conclusiones fiables; sin embargo, dadas
las dificultades asociadas al diagnóstico de asma, y la ausencia de síntomas
o signos patognomónicos en esta enfermedad, son los fenotipos
relacionados con el asma los objetivos habitualmente analizados en las
distintas publicaciones, y éstos varían entre autores. Los criterios utilizados
para el diagnóstico de asma son, con frecuencia, dispares y, en algunas
ocasiones, se reducen a datos obtenidos de un cuestionario y a una escala
visual de puntuación de síntomas. En nuestro trabajo, por el contrario, los
pacientes incluidos en el mismo, se han evaluado en cinco ocasiones a lo
largo de un año, antes de clasificarlos según la gravedad del asma y, en
todos los casos, el tratamiento se ajustó al mínimo necesario para mantener
controlada la enfermedad. La hiperreactividad bronquial, entendida como
broncodilatación o broncoconstricción positiva, estaba presente en todos los
pacientes que fueron catalogados como asmáticos. De ello se infiere que, a
diferencia de lo que sucede en numerosos estudios publicados, la población
incluida estaba correctamente diagnosticada y seleccionada.
Los cisteinil leucotrienos, entre otros muchos mediadores, han sido
implicados en la fisiopatología del asma. Son importantes en la respuesta
inflamatoria, inducen broncoconstricción, edema e hipersecreción de la
mucosa bronquial, así como migración eosinofílica. La vía de síntesis de los
leucotrienos está bien caracterizada, siendo sus tres enzimas principales la
5-LO, la FLAP y la LTC4S con sus correspondientes genes: ALOX5, ALOX5AP
y gen de LTC4S. Estas enzimas y sus metabolitos han sido objeto de un
gran número de estudios. Su implicación en el fenotipo asmático, en la
gravedad del asma y, en especial, en los asmáticos intolerantes a AINEs, ha
quedado ampliamente demostrada. Así mismo, los fármacos
antileucotrienos han demostrado ser eficaces en el tratamiento del asma en
una amplia serie de pacientes. Se ha sugerido, en base a los resultados de
algunos estudios, que la respuesta terapéutica a los antileucotrienos, los
fenotipos de asma y su gravedad, pueden estar relacionados con el
genotipo de las principales enzimas implicadas en la producción de
leucotrienos. Sin embargo, estos datos no han sido corroborados en todos
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
74
los estudios. Un mismo polimorfismo se ha considerado de protección o de
riesgo frente un mismo fenotipo por distintos autores, en estudios sobre
poblaciones de etnias similares o diferentes. Por este motivo, el efecto que
tienen los distintos genotipos de las regiones promotoras de ALOX5,
ALOX5AP y LTC4S, sobre los fenotipos asmáticos no está, a día de hoy,
suficientemente aclarado.
En este trabajo, se ha analizado la implicación que diferentes
polimorfismos en las regiones promotoras de dichos genes, tienen sobre la
prevalencia de asma y sobre la gravedad de la misma, en la población
asmática de Gran Canaria. Cabe destacar, como ya se ha mencionado en
los criterios de inclusión, que los pacientes asmáticos se seleccionaron y
catalogaron de forma rigurosa, tras controlar su evolución durante un
periodo de un año, mediante visitas trimestrales, realizadas siempre por el
mismo facultativo. Se efectuaron un total de 711 visitas durante este
periodo, incluyendo las cinco visitas programada por cada paciente asmático
y las no programadas. La población de asmáticos se separó en dos grupos,
según los criterios de la gravedad de la GEMA: pacientes con asma
persistente grave y pacientes sin asma persistente grave. Dada la
importante relación existente entre la vía de síntesis de los leucotrienos y la
intolerancia a AINEs, se analizó esta última variable tanto conjuntamente
con el asma como por separado, a pesar del reducido número de pacientes
con estas características en nuestra muestra. No es esta asociación, sin
embargo, uno de los objetivos para los que se diseñó el estudio que nos
ocupa.
Los 111 pacientes asmáticos estudiados eran, en su mayoría,
mujeres con una edad media de 40 años. Los controles no asmáticos se
ajustaron, así mismo, a estas variables. La mayor presencia de mujeres es
común a otras publicaciones en las que se incluye pacientes asmáticos.
Analizando los datos obtenidos a partir de la historia clínica, destaca la
intensa asociación existente entre la atopia y la clasificación del asma en
función de la gravedad. De los 22 pacientes con diagnóstico de asma
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
75
intrínseco (no atópica), un 86% (n=19) tenían asma persistente grave,
frente a solo un 48% en el grupo de pacientes asmáticos atópicos con asma
persistente grave. Al analizar estos datos desde otra perspectiva, la atopia
está presente en un 69,4% de los pacientes con asma persistente grave y
en un 93,9% de los pacientes con asma no grave. Existe, en nuestra
población, una relación negativa entre presencia de atopia y gravedad del
asma; y una relación positiva, aun mayor, entre no ser atópico y padecer
asma de mayor gravedad. Curiosamente, en el último Congreso de la
European Respiratory Society (ERS), celebrado en la ciudad alemana de
Munich en septiembre de 2014, se ha presentado los resultados de un
estudio multicéntrico y multipaís sobre epidemiología del asma grave en
Europa, en el que se han reclutado entre 2010 y 2014 un total de 216
pacientes con asma grave, de los cuales, casi el 95% eran atópicos, hecho
que suscitó una enorme controversia durante la discusión. En nuestro
estudio, la edad de comienzo del asma intrínseco era significativamente
mayor que la del asma extrínseco, como se ha descrito en la mayoría de
series. No existen, sin embargo, diferencias significativas entre ambas, en
lo referente a años de evolución del asma. Ello se puede explicar porque el
asma extrínseco debuta en etapas más tempranas de la vida, mientras que
la edad media de los pacientes con asma intrínseco es ligeramente mayor.
El objetivo principal al realizar el estudio de casos-controles fue
conocer en qué medida determinados polimorfismos afectaban, en nuestra
población, al riesgo de padecer asma y al riesgo de que ésta fuera más
grave. Las variantes polimórficas se compararon de forma individual y
conjuntamente en cada uno de los tres grupos. Los hallazgos obtenidos se
discuten a continuación.
Analizando los resultados por separado en cada polimorfismo,
destacó:
ALOX5: La enzima 5-LO es codificada por el gen ALOX5, localizado en el
cromosoma 10q11.12. La actividad de la 5-LO se ha asociado con algunos
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
76
procesos inflamatorios, tales como asma, arterioesclerosis e hipertensión
pulmonar (142). Estudios iniciales realizados por Hoshiko y cols. en 1990
(143), y posteriormente corroborados por In K y cols. en 1997 (80),
identificaron variantes en series de seis nucleótidos repetidos en tándem en
la región promotora principal del gen ALOX5. Este polimorfismo de la región
promotora, incluiría entre tres y seis repeticiones en tándem de la secuencia
de nucleótidos “5´-GGGCGC-3”, localizada a 212-88 bp corriente arriba de
ATG. Esta región de transcripción, rica en G-C, contiene patrones de
reconocimiento para las enzimas Sp1/Erg-1 (proteínas que contienen un
motivo en dedos de zinc, mediante el cual se unen directamente al ADN y
favorecen la transcripción), cruciales para el inicio de la transcripción. Cinco
repeticiones son el alelo más frecuente en poblaciones caucásicas y
afroamericanas, reconocida como la variante mayor o “salvaje”. Las
mutaciones en el número de sitios de unión de Sp1 se asociaron con una
actividad disminuida del gen en cultivos tisulares. In K y cols., mediante
ensayos in vitro que implicaban cambios en el recorrido electroforético,
dependiente de la unión de factores de transcripción al DNA (EMSA, por sus
siglas en ingles Electrophoretic Mobility shift assay (144, 145)), determinan
que, en todas las mutaciones, existía unión de los factores de transcripción
al DNA. Esta unión era considerablemente más fuerte en el alelo salvaje,
concluyendo que los alelos mutados tienen una menor afinidad o un número
menor de sitios de unión viables para Sp1 / Egr-1.
A pesar de que en estos primeros estudios (80, 143), las variantes
alélicas de la región promotora de ALOX5 se asociaban, in vitro, con una
menor actividad en la transcripción, otros autores han encontrado
resultados opuestos. Estudios de expresión genética en leucocitos de
individuos sanos homocigotos para las variantes “no 5 repeticiones” (146),
presentaban mayor expresión de 5-LO, FLAP y LTA4H, comparando con
homocigotos para el alelo salvaje (cinco repeticiones), sugiriendo que las
variantes “no 5 repeticiones” se asocian con una mayor producción de
leucotrienos.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
77
Aunque las variantes alélicas de la región promotora de ALOX5 se
asocian a alteraciones en la actividad transcripcional en estudios in vitro, no
queda claro cómo influyen estas variantes en el fenotipo de asma. Mougey y
cols. (147), analizaron un total de 270 niños de entre 6 y 17 años, con
asma mal controlada a pesar de un correcto tratamiento de base. Se definió
asma mal controlada como: puntuación del cuestionario de control de asma
ACQ > 1.25, dos o más visitas no programadas a su médico por asma o uso
de ciclos de esteroides orales en doce meses, despertares nocturnos
secundarios al asma al menos uno en semana o necesidad de
broncodilatadores de rescate al menos una vez en semana durante un mes.
Los pacientes se dividieron según genotipo en dos grupos: pacientes con al
menos un alelo salvaje, cinco repeticiones del patrón de reconocimiento de
Sp1: (X/5 + 5/5) =230 pacientes, 84%; y pacientes con cualquier otra
combinación (X/X)=40 pacientes, 16%. Se analizaron valores de FEV1%,
datos de control de síntomas, niveles de FeNO y valores de LTE4 en orina
(LTE4u). Encontraron una mayor alteración de la función respiratoria y
niveles más elevados de CysLT en los pacientes portadores de dos copias de
la variante “no 5-repeticiones” X/X (homocigotos para la variante menor).
Sólo se observó esta asociación en los individuos portadores de dos
variantes menores, lo que sugería que los fenotipos LTE4u y FEV1% se
expresaban con carácter recesivo. Los pacientes homocigotos para la
variante menor también presentaron puntuaciones más altas en ACQ,
sugiriendo mayor sintomatología de asma. Este grupo tenía prescrito con
más frecuencia tratamiento con antileucotrienos. Estos resultados sugieren
que estas variantes alélicas sobre la región promotora de ALOX5, con un
número variable de repeticiones en tándem de motivos de unión para el
factor de transcripción Sp1, tienen influencia positiva sobre la actividad de
ALOX5 y, secundariamente, sobre la producción de leucotrienos. En esta
misma línea, Lima y cols. (148) encontraron que los asmáticos portadores
de la variante “no 5 repeticiones” y tratados con un inhibidor del receptor
de leucotrienos (montelukast), tenían un riesgo un 73% menor de tener
una o más crisis, comparando con pacientes homocigotos para el alelo
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
78
salvaje, debido a que las variantes alélicas tienen mayor expresión de 5-LO
y más altos niveles de CysLT.
Entre pacientes asmáticos con intolerancia a AINES, aquellos con
variantes menores presentaron mayor grado de obstrucción bronquial,
comparado con homocigotos para la variante común (130). Así mismo,
Kalayci y cols. (121), encontraron que pacientes homocigotos para la
variante menor tenían una mayor probabilidad de tener asma persistente
grave y mayor HRB asociada al ejercicio, comparado con pacientes con
genotipo homocigoto para la variante mayor.
Los resultados de nuestro estudio coinciden en que el alelo 5-
repeticiones es el más frecuente en población caucásica: 70% en controles,
74% en pacientes asmáticos (78% en asma persistente grave y 69% en los
asmáticos no persistente grave). Destaca, no obstante, que es en el grupo
de pacientes con asma persistente grave en donde más frecuentemente se
localiza el alelo común, comparando con el grupo control y pacientes
asmáticos no grave (78%, 70% y 69% respectivamente), sugiriendo, a
priori, un efecto favorable a padecer asma y a que ésta sea más grave
cuando se tiene el alelo común, lo que podría indicar una mayor actividad
del gen. El genotipo homocigoto para la variante común está presente en un
55% de los pacientes controles, frente a un 67,7% de los pacientes con
asma persistente grave (un 60% en todos los pacientes asmáticos). El
genotipo homocigoto para cualquiera de las variantes menores es de un
13,4% en controles, frente a un 11,3% en asma grave y un 11,7% en el
total de asmáticos.
En nuestro estudio, el análisis de riesgo de los distintos polimorfismos
de la región promotora de ALOX5, considerando los cuatro modelos posibles
de herencia (codominante, dominante, recesivo y aditivo), comparando
entre controles y los distintos grupos de asmáticos por separado y los
asmáticos totales, no se aprecia ninguna relación destacable. Al realizar el
análisis de riesgo, comparando los asmáticos entre sí, resulta igualmente no
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
79
significativo. Dicho de otra manera, ninguna combinación de alelos,
independientemente del modelo de herencia, parece ejercer un efecto
protector o de riesgo sobre la posibilidad de padecer asma, ni sobre la
gravedad de la misma, en nuestra población.
En nuestro trabajo, tampoco hemos encontrado asociación
significativa entre los polimorfismos de ALOX5 y la gravedad del asma,
analizando a los pacientes asmáticos con tolerancia a AINEs (n=98), si bien,
existía una tendencia a la significación entre ambas variables (p=0,066). No
encontramos, tampoco, asociación (p=0,632) entre los polimorfismos y la
gravedad del asma en los pacientes con intolerancia a AINEs (n=13).
Comparando con el alelo más común (5-repeticiones, variante
mayor), las variantes “no 5-repeticiones” (variantes menores) se han
asociado con una respuesta variable a antileucotrienos, tanto a los
inhibidores de leucotrienos como a los antagonistas del receptor,
respaldando el hecho de que las variantes genéticas interfieren, en mayor o
menor medida, sobre la producción final de leucotrienos. Drazen y Telleria
(149, 150), por separado, fueron los primeros en encontrar una asociación
entre las variaciones en las repeticiones en tándem de la región promotora
de ALOX5, con la expresión de 5-LO y la respuesta a fármacos
antileucotrienos. Encontraron que la adición o delección de motivos de
unión de Sp1/Erg-1 (variantes menores), resultaba en una menor actividad
del gen y en una menor respuesta a estos fármacos, en pacientes
homocigóticos para el alelo “no 5-repeticiones”. Este resultado era el
esperado, considerando que las variaciones del alelo conllevan una menor
expresión de la 5-LO. En teoría, cuanta mayor implicación tengan los
leucotrienos en la patogenia del asma, mayor será la respuesta a los
fármacos antileucotrienos.
En otros estudios farmacogenéticos realizados con montelukast en
sujetos sanos, los resultados fueron justo los contrarios: individuos
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
80
homocigotos para las variantes “no 5 repeticiones” (130), presentaban
mayor expresión de 5-LO y LTA4H al compararlos con homocigotos para el
alelo más común, sugiriendo que las variantes menores se asocian con una
mayor producción de leucotrienos.
En nuestra población, un porcentaje significativamente mayor de
pacientes con asma persistente grave recibía tratamiento con montelukast
(85%), comparado con el grupo de asmáticos no persistente graves (20%).
El montelukast es un fármaco inhibidor del receptor de leucotrienos CysLT1
(en España no está comercializado el fármaco inhibidor de la enzima 5-LO).
Estas diferencias son implícitas a los criterios de gravedad y se justifican en
la necesidad de administrar más medicación al primer grupo para alcanzar
el control del asma. Dichas diferencias encontradas son también
extrapolables a otros fármacos reservados a escalones terapéuticos
asociados con el asma de mayor gravedad, como son los broncodilatadores
de larga duración, los corticoides inhalados a altas dosis, las teofilinas y los
anticolinérgicos.
Otros autores han concluido que existe suficiente evidencia para
afirmar que las variantes menores en la región promotora de ALOX5 pueden
influir negativamente sobre el asma. En nuestro estudio, no se encontró que
existiera un riesgo relativo mayor de padecer asma o de que la enfermedad
fuera más grave como consecuencia de los distintos polimorfismos de la
región promotora de ALOX5, cualquiera que fuera el modelo de herencia.
Así mismo, tampoco encontramos relación entre el citado polimorfismo y la
tolerancia o intolerancia a AINEs, independientemente del fenotipo de
gravedad del asma al que estuviera asociada.
ALOX5AP: El gen ALOX5AP se localiza en el cromosoma 13q12, contiene
cinco pequeños exones de longitudes entre 71-478 pares de bases, y cuatro
intrones de mayor longitud (151, 152). Aunque se ha identificado dos SNPs
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
81
en intrones al clonarse el gen, no se ha determinado, sin embargo, la
frecuencia de estos polimorfismos ni su implicación en el asma (151).
Sayers y cols. (131) identificaron dos polimorfismos en la región promotora
del gen ALOX5AP: un SNP consistente en una sustitución de guanina por
adenina en la posición 336 (-336 G>A), siendo este grupo el primero en
describirlo, y otro polimorfismo consistente en repeticiones de longitud
variable de adenina (A). Este segundo polimorfismo había sido descrito
previamente, con ligeras diferencias en la longitud de las repeticiones de A,
por Koshino y cols. (132), quienes encontraron asociación con asma en
población japonesa, tras analizar la región promotora de ALOX5AP en 71
pacientes asmáticos y 71 controles no asmáticos. Estos autores concluyeron
que el alelo con repeticiones de 21 pares de bases de un solo nucleótido, A,
en la región promotora de ALOX5AP, estaba presente más frecuentemente
en pacientes asmáticos (52/71=73,2%; pacientes sanos: 39/71=54,9%),
comparado con el alelo de 18 repeticiones de A. Mientras que Koshino y
cols. identificaron fragmentos de poli A con longitudes de 18A y 21A y
asociaron el polimorfismo de 21 repeticiones (21/21) con asma en población
japonesa. Sayers, Kim y cols. (130, 131), por separado, identificaron
polimorfismos de 19 y 23 repeticiones de A, y no encontraron asociación
con asma en poblaciones caucásica y coreana, respectivamente. Estos
hallazgos sugieren que podría existir una diferencia étnica en la distribución
genotípica de ALOX5AP. Además, Sayers y cols. (131) encontraron una
frecuencia del alelo común (23A) del 89% en pacientes con asma (n=183),
frente a un 88% en los controles no asmáticos de población británica. A su
vez, Kim y cols. (130), en un estudio realizado con población coreana,
evidencian una prevalencia del 84% en asmáticos (n=107), y del 78,9% en
los controles, no encontrando diferencias significativas en la frecuencia
alélica de pacientes intolerantes a AINES, comparado con los tolerantes. No
hallaron, tampoco, diferencias significativas en la frecuencia de genotipos,
analizándolos bajo los supuestos de herencia dominante, co-dominante y
recesiva, entre pacientes con intolerancia a AINES, comparados con
controles no asmáticos, ni comparados con pacientes asmáticos tolerantes a
AINES.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
82
En nuestra población, el alelo 361 pb (23 repeticiones de A), estaba
presente en el 84% de los pacientes con asma persistente grave, en un
80% en asmáticos no graves y en un 81% de controles, siendo el alelo más
frecuente, en concordancia con los hallazgos descritos por otros autores
(130, 131). Al comparar los controles con la totalidad de nuestra muestra
de pacientes asmáticos, y con los grupos de asmáticos por separado según
criterios de gravedad, no se apreció riesgo relativo mayor de padecer asma
en ninguno de los cuatro modelos de herencia: codominate, dominante,
recesiva y aditiva.
Se encontró un riesgo relativo menor de padecer asma persistente
grave, con modelo de herencia codominante, en el genotipo heterocigoto
(OR=0,37. 95% IC=0,15-0,94). Sin embargo, este resultado no se
reprodujo en los modelos de herencia dominante o recesiva en los pacientes
homocigotos. Tampoco se reprodujo al comparar, en este mismo modelo de
herencia, a los pacientes con asma persistente grave con el grupo control.
Por lo tanto, dado que esta asociación sólo se obtuvo en el modelo
codominante, es muy probable que este resultado corresponda a un error
de tipo I ya que se compararon 16 pacientes frente a 9, es decir, un
número muy reducido. Aclarado este punto, podemos concluir que no
encontramos relación entre el polimorfismo consistente en repeticiones
variables de A en la región promotora de ALOX5AP y la presencia de asma o
la gravedad de la misma. Kedda y cols. (153), en un estudio en población
caucásica que incluía 584 pacientes asmáticos, divididos en categorías
según gravedad del asma, y 457 controles no asmáticos, así como otros
autores (130, 131), tampoco han demostrado ninguna asociación entre las
repeticiones de A y el riesgo de padecer asma, ni entre este polimorfismo y
la gravedad de la misma.
Al analizar por separado la tolerancia / intolerancia a AINEs, no
encontramos relación significativa entre los diferentes alelos y genotipos,
comparando pacientes asmáticos con buena tolerancia a AINEs (p=0,087).
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
83
Tampoco existía asociación entre los polimorfismos de la región promotora
de ALOX5AP y la gravedad del asma (p=0,529), analizando solo a los
pacientes con intolerancia a AINEs (n=13).
LTC4S: La tercera enzima en la biosíntesis de cisteinil leucotrienos es la
LTC4S. Se trata, como ya se ha comentado, de una glutatión transferasa
clave en la síntesis de cisteinil leucotrienos, al convertir LTA4 a LTC4. El gen
que codifica la LTC4S se localiza en el brazo largo del cromosoma 5 (5q35),
una región asociada con asma en estudios de ligamiento y próxima a la
zona 5q31-33, que incluye varios genes candidatos de asma (154). El gen
de la LTC4S incluye unos 2.5 kilobases, contiene 5 pequeños exones y
algunos supuestos motivos de ligamiento o zonas de regulación, en la
región 5´ no transcrita.
Sanak y cols. (83) describieron por primera vez en 1997 una
transversión de A por Citosina (C), 444 pares de bases corriente arriba del
lugar de inicio de la transcripción del gen de la LTC4S (A -444 C):
encontraron una asociación entre el alelo C-444 y la existencia de asma
exacerbado por AINEs (AERD), con un riesgo relativo de 3.89 (95% CI 1.57
– 8.98), aunque añadían la posibilidad de que existiera desequilibrio de
ligamiento con otros genes. Con posterioridad, se ha visto que existe un
aumento en la expresión del RNAm de LTC4S en eosinófilos de sangre
periférica, en pacientes asmáticos con el alelo C en posición -444,
comparado con controles asmáticos y no asmáticos sin este polimorfismo,
además, este aumento de expresión era aún mayor en los pacientes con
asma inducida por aspirina (AERD) (103, 155). Los trabajos iniciales de
Sampson y cols. (135) mostraron, así mismo, asociación entre la presencia
de asma persistente grave y el polimorfismo C-444, sugiriendo que la
predisposición genética a la mayor producción de Cys-LT puede ser un
factor de riesgo de padecer asma grave, independiente de la tolerancia a
AINEs.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
84
Estos hallazgos iniciales confirieron un papel relevante al SNP A-444
C del gen de la LTC4S en la gravedad del asma y del AERD. Conviene
señalar, sin embargo, que estos estudios se realizaron en población europea
exclusivamente, con un número escaso de individuos, y que los criterios
utilizados para definir la gravedad del asma eran, en general, poco
rigurosos. Sus resultados son, por lo tanto, cuestionables. Con la intensión
de corregir estas limitaciones, Kedda y cols. (134) realizaron con
posterioridad un estudio incluyendo 604 pacientes asmáticos y 458
controles no asmáticos, todos caucásicos australianos. Los pacientes
asmáticos se dividieron según gravedad en asma persistente leve,
moderada y grave, en base a un sistema de puntuación, que incluyó los
siguientes criterios: función pulmonar, uso de corticoides orales en los
últimos 12 meses y dosis diaria de corticoides inhalados, demanda semanal
de broncodilatadores de rescate, síntomas diurnos, despertares por asma,
asistencia a servicios de urgencias y hospitalizaciones. Encontraron una
asociación leve, no significativa, entre el SNP A-444 C y la existencia de
asma, pero no entre la presencia del alelo C y la gravedad del asma o la
intolerancia a AINEs, al contrario que Sampson y cols. (135). Los resultados
de este estudio coinciden con el realizado por Brauer y cols. (156) en
población danesa, en el que no objetivaron relación entre la gravedad del
asma y los SNPs en la región promotora del gen de LTC4S. En población
japonesa, Kawasagishi y cols. (129) tampoco encontraron diferencias
significativas entre los alelos del gen, al comparar datos de función
respiratoria y dosis de corticoides inhalados en 160 pacientes asmáticos, 60
de ellos con intolerancia a AINEs. En la misma línea, en un estudio realizado
en población infantil de origen coreano, en el que se incluyó a 445 niños con
asma y 146 niños no asmáticos y no atópicos, concluyeron que existía
relación entre el alelo C (genotipos CC, AC) y una menor respuesta
bronquial a metacolina, comparado con homocigotos para A, asociando este
SNP con una menor respuesta bronquial en niños con asma (157). Puesto
que el SNP -444 A/C no ha demostrado tener ningún efecto funcional sobre
la transcripción del gen, se ha sugerido que este SNP podría estar en
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
85
desequilibrio de ligamiento con otro con actividad funcional, no relacionada
con la región promotora de LTC4S (136, 157).
En nuestro estudio, un 25% del grupo control presentaba el alelo C
frente a un 23% de la población de asmáticos. Al analizarlo por separado,
encontramos que el 30% de pacientes con asma persistente grave lo
presentaban, frente al 20% de los pacientes con asma no persistente grave.
En cuanto al genotipo homocigoto para A, lo presentaban el 55% de los
controles, el 55.7% de los asma persistente grave y el 63% de los
asmáticos no persistente grave, siendo estos datos superponibles a los de
las publicaciones anteriormente mencionadas. Al analizar el riesgo relativo
de padecer asma o de que esta fuera más grave, considerando los cuatro
modelos de herencia posibles, no se encontró un riesgo relativo mayor en
ninguno de los supuestos. En pacientes asmáticos con buena tolerancia a
AINEs no se apreció, tampoco, asociación significativa de la gravedad del
asma con la presencia del SNP en C-444 (p=0,474). Así mismo, no
encontramos relación (p=0,592) entre los SNPs y la gravedad del asma, en
pacientes con intolerancia a AINEs (n=13), en contraste con los hallazgos
de Sanak y cols. (83), quienes, tras identificar por primera vez la
transversión A por C en la posición -444, describieron una relación
significativa entre este SNP y la intolerancia a AINES en asmáticos. Kedda y
cols. (134), al igual que nosotros, no encontraron evidencias de asociación
entre el SNP C-444 y la presencia de asma en pacientes con intolerancia a
AINEs.
En otros estudios realizados en población española, se ha publicado
resultados similares. García y cols. (158) no detectaron ninguna asociación
entre el alelo C-444 y la presencia de asma, la gravedad de la misma ni la
intolerancia a AINEs, en un estudio en el que incluyeron 123 pacientes
asmáticos y 103 controles no asmáticos.
Los resultados discutidos en los párrafos anteriores se han incluido en
un meta-análisis publicado en 2012 (159), en el que se han analizado
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
86
conjuntamente con los datos de otras 12 publicaciones, sumando un total
de 3042 pacientes asmáticos y 1902 controles. Se concluyó que ser
portador del alelo C (CC + AC) no implica un riesgo más elevado de padecer
asma, comparado con homocigotos AA, cuando se incluía a todos los
pacientes. Esta falta de asociación no se modificaba al analizar por separado
distintos grupos, divididos en función de la edad, y el resultado sólo variaba
al estratificarlos por etnias. Se encontró asociación significativa entre el
riesgo de padecer asma en población caucásica y el SNP C (OR = 1.21, 95%
IC = 1.02-1.44, p= 0.03), pero no en poblaciones asiáticas ni afro-
americana. Se ha objetivado, también, asociación con el riesgo de padecer
asma con tolerancia a AINEs (OR = 1.36, 95% IC = 1.12 -1.65, p= 0.002),
lo que sugiere que el SNP -444 A/C podría ser un marcador de asma en
población caucásica.
A pesar de que existen algunas publicaciones y meta-análisis que han
asociado con el asma algunos de los polimorfismos estudiados, la mayoría
han concluido, al igual que nosotros, que no existía asociación significativa.
Es muy probable que el reducido tamaño muestral sea un factor decisivo en
estos resultados. Los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS)
publicados hasta la fecha no han encontrado tampoco ningún polimorfismo,
en las principales enzimas de la vía de síntesis de leucotrienos, que tenga
asociación con asma. Un meta-análisis de GWAS recientemente publicado
(25), ha identificado, por primera vez, cuatro loci asociados a asma en tres
grupos étnicos diferentes: loci en 17q21 y próximo a los genes de IL1RL1,
TSLP e IL33. Ha concluido que estos resultados sugieren que algunos loci de
susceptibilidad para asma son constantes, incluso cuando existen
diferencias ancestrales, siempre que se investigue sobre series de pacientes
suficientemente numerosas, y que existen asociaciones genéticas
específicas de etnias, que contribuyen a la compleja arquitectura genómica
del asma.
En nuestro estudio, con el fin de detectar un posible efecto sinérgico
entre los tres genes sobre el asma, es decir, una asociación aditiva entre la
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
87
presencia de alelos considerados de riesgo, en cualquiera de los
polimorfismos estudiados, con la enfermedad, realizamos un análisis
adicional. Se consideraron de riesgo los siguientes alelos: el alelo C del SNP
LTC4S−444 A/C, el alelo que determina un número de sitios de unión para
Sp1/Egr1 distinto de 5 en ALOX5 −176/−147 y el alelo de 357 pb del
ALOX5AP −169/−146. La presencia de alelos de riesgo se organizó en
categorías según el número de ellos que poseía un individuo (ninguno, uno,
dos, o más de dos), considerando los tres polimorfismos en conjunto. No se
observó efecto epistático alguno, ni asociación con la enfermedad en
ninguna combinación.
Cabe destacar que, en nuestro estudio tampoco, encontramos
relación entre la gravedad del asma y una mayor respuesta terapéutica a
fármacos antileucotrienos. El número de pacientes con asma persistente
grave que recibía tratamiento con antileucotrienos, era significativamente
mayor que el grupo de pacientes con asma no persistente grave, al igual
que sucede con los otros fármacos empleados para controlar la enfermedad.
Precisamente, una característica del asma grave es la mayor demanda de
medicación, ya sea debido a una menor respuesta a la misma o a la
necesidad de dosis más elevadas, debido a alteraciones fisiopatológicas y/o
estructurales de base más evolucionadas. Una respuesta significativamente
mayor a los fármacos antileucotrienos en los pacientes con los
polimorfismos estudiados implicaría, posiblemente, una mejoría clínica
suficiente como para reducir el escalón de gravedad del asma en el que se
encuentran y descatalogar a algunos pacientes del grupo de “asma
persistente grave”, con lo que el número de pacientes en tratamiento con
antileucotrienos y portadores de los polimorfismos aumentaría entre los
pacientes asmáticos no graves. En nuestra población, el uso de
antileucotrienos en cada grupo era comparable con el resto de fármacos.
Esto no excluye la posibilidad de que estos polimorfismos sean capaces de
identificar a aquellos pacientes asmáticos para los que los fármacos que
actúan sobre la vía de los leucotrienos pudieran tener un efecto terapéutico
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
88
mayor y una mayor contribución sobre las alteraciones fisiopatológicas del
asma.
Conviene señalar que, para poder emitir conclusiones definitivas, son
necesarios estudios de cohortes con un número más elevado de
participantes, de mayor diversidad étnica y con pacientes correctamente
categorizados, tanto conceptualmente en asmáticos o no asmáticos, como
en su clasificación según criterios de gravedad. Características tales como
tolerancia o intolerancia a AINEs, en estos pacientes, son relevantes, puesto
que la fisiopatología de la intolerancia a AINES involucra directamente a la
vía de la ciclooxigenasa y a la vía de síntesis de los leucotrienos. Nuestro
estudio sugiere que los polimorfismos descritos en las regiones promotoras
de los genes ALOX5, ALOX5AP y LTC4S, no constituyen un riesgo genético
para padecer asma, ni para determinar la gravedad de la misma, en nuestra
población. Tampoco encontramos diferencias significativas entre aquellos
pacientes con intolerancia a AINES y los que los toleraban, comparando
entre si los grupos de pacientes asmáticos graves, los no graves y los
controles no asmáticos.
Una de las principales fortalezas de nuestro trabajo son los rigurosos
criterios que se han aplicado, tanto para la inclusión de los pacientes
asmáticos, como para la clasificación de estos según la gravedad. Ningún
estudio publicado hasta la fecha basa los criterios de gravedad en
seguimientos previos, con visitas trimestrales durante un año. En cada
visita se reevaluaba la clasificación según la gravedad, tras la recogida de
datos clínicos detallados y de función respiratoria. La mayoría de los
pacientes llevaba años acudiendo regularmente a consultas y habían sido
diagnosticados de asma varios años antes de ser incluidos en el estudio.
Excepto dos pacientes, el resto permaneció en la misma categoría de
gravedad a lo largo de todo el estudio. En esos dos casos en que se
modificó el escalón de gravedad, los cambios fueron los siguientes: uno
bajó a asma persistente moderada desde asma persistente grave y el otro
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
89
fue justo al revés, es decir, pasó de asma persistente moderada a asma
persistente grave.
Todos los pacientes reclutados en este estudio procedían de Canarias
y eran de raza caucásica, al igual que sus padres. No se incluyeron
pacientes de los que se desconociera la procedencia de los padres. Dada las
características endogámicas propias de la insularidad y la influencia
sudamericana presente en Canarias, esperábamos obtener datos más
dispares respecto a aquellos obtenidos en población caucásica anglosajona
(133, 136), australiana (153) o incluso española, de pacientes reclutados en
la Península Ibérica (158). A pesar nuestras diferencias y de la evidente
limitación de nuestro trabajo en cuanto al tamaño muestral, nuestros datos
son concordantes con los obtenidos en estas publicaciones.
El asma es una enfermedad crónica muy compleja. Los distintos
fenotipos existentes, los diferentes criterios de inclusión utilizados en las
distintas publicaciones, la influencia del ambiente en la expresión genética,
su carácter poligénico, así como la interacción entre genes y de estos con el
medio, hacen que resulte complicado obtener un mapa genético con los
datos disponibles hasta ahora. La vía de la 5-LO desempeña un papel
fundamental en la patogenia del asma, las propiedades proinflamatorias de
sus metabolitos están perfectamente contrastadas. Sin embargo, no queda
completamente aclarado hasta qué punto los polimorfismos estudiados en
los genes de las tres principales enzimas implicadas en la producción de
Cys-LT afectan al fenotipo asmático. Parece plausible que su influencia no
sea tan importante como inicialmente se preveía. Una posible explicación es
el limitado efecto que cada polimorfismo por separado aporta a la
enfermedad y que existan mecanismos de control genéticos que minimicen
el impacto de estos polimorfismos sobre la enfermedad (interacción gen-
gen).
Nuestros resultados no han demostrado ninguna asociación
significativa con asma ni con la gravedad del asma, tanto analizando los
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
90
polimorfismos por separado como conjuntamente. El reducido tamaño de la
muestra es posiblemente un factor clave en la falta de significación
estadística. En este sentido, el escaso número de pacientes con intolerancia
a AINEs entre la población de asmáticos incluidos, sesga los resultados en
los estudios de asociación con los polimorfismos, siendo estos, al igual que
con el resto de fenotipos estudiados, no significativos.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
91
7. CONCLUSIONES
• Nuestro estudio no encuentra asociación entre los polimorfismos
estudiados en la región promotora de LTC4S, ALOX5 y ALOX5AP, con
el riesgo de padecer asma.
• Tampoco se identifica asociación alguna entre los polimorfismos
estudiados en la región promotora de LTC4S, ALOX5 y ALOX5AP, con
el riesgo de padecer asma más grave.
• El análisis de combinaciones genéticas, buscando un posible efecto
aditivo o epistático de los polimorfismos mencionados, tampoco
resulta significativo en su asociación con asma y/o gravedad.
• Existe, en nuestra población, una relación negativa entre presencia
de atopia y gravedad del asma; y una relación positiva, aun mayor,
entre no ser atópico y padecer asma de mayor gravedad. El asma
intrínseca es significativamente más frecuente entre nuestros
pacientes con diagnóstico de asma persistente grave.
• La Intolerancia a AINEs no se asocia con ninguno de los
polimorfismos estudiados, ni con la gravedad del asma, en nuestra
población.
• La movilidad de nuestros pacientes entre los distintos escalones de
gravedad en el asma, durante el año de estudio con visitas
trimestrales, es menor del 2%.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
92
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bousquet J, Mantzouranis E, Cruz AA, Aït-Khaled N, Baena-Cagnani
CE, Bleecker ER, Brightling CE, Burney P, Bush A, Busse WW, Casale TB,
Chan-Yeung M, Chen R, Chowdhury B, Chung KF, Dahl R, Drazen JM, Fabbri
LM, Holgate ST, Kauffmann F, Haahtela T, Khaltaev N, Kiley JP, Masjedi MR,
Mohammad Y, O'Byrne P, Partridge MR, Rabe KF, Togias A, van Weel C,
Wenzel S, Zhong N, Zuberbier T Uniform definition of asthma severity,
control, and exacerbations: document presented for the World Health
Organization Consultation on Severe Asthma. J Allergy Clin Immunol.
2010;126(5):926-38
2. Alcántara M. Epidemiología e historia natural del asma. En: Asma y
Alergia: Epidemia del Siglo XXI Alcántara M (Ed) Universidad Internacional
de Andalucía (ISBN: 978-84-7993-227-5). 2012;14-25.
3. Executive Committee G. GEMA 2009 (Spanish guideline on the
management of asthma). J Investig Allergol Clin Immunol. 2010;20 Suppl
1:1-59.
4. García-Marcos L, Quirós AB, Hernández GG, Guillén-Grima F, Díaz
CG, Ureña IC, Pena AA, Monge RB, Suárez-Varela MM, Varela AL, Cabanillas
PG, Garrido JB. Stabilization of asthma prevalence among adolescents and
increase among schoolchildren (ISAAC phases I and III) in Spain. Allergy.
2004;59(12):1301-7.
5. Sobradillo V, Miravitlles M, Jiménez CA, Gabriel R, Viejo JL, Masa JF,
Fernández-Fau L, Villasante C. Epidemiological study of chronic obstructive
pulmonary disease in Spain (IBERPOC): prevalence of chronic respiratory
symptoms and airflow limitation. Arch Bronconeumol. 1999;35(4):159-66.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
93
6. Sánchez-Bahíllo M, García-Marcos L, Pérez-Fernández V, Martínez-
Torres A, Sánchez-Solís M. Evolución de la mortalidad por asma en España,
1960–2005. Arch Bronconeumol. 2009;45:123-8
7. Martínez-Moratalla J, Almar E, Sunyer J, Ramos J, Pereira A, Payo F,
Antó JM. European Asthma Study. Identifying and treating young adults
with epidemiological criteria for asthma in five areas of Spain. Spanish
Group of the European Asthma Study. Arch Bronconeumol.
1999;35(5):223-8.
8. Bellido JB, Sunyer J. The evolution of mortality due to asthma in the
age
groups 5-34 and 5-44, Spain, 1975-1991. Gac Sanit 1997; 11: 171-5.
9. Martínez-Moragón E, Serra-Batllés J, De Diego A, Palop M, Casan P,
Rubio-Terrés C, Pellicer C. Coste económico del paciente asmático en
España (estudio AsmaCost). Arch Bronconeumol. 2009;45:481-6
10. Blasco Bravo AJ, Pérez-Yarza EG, Lázaro y de Mercado P, Bonillo
Perales A, Díaz Vazquez CA, Moreno Gadó A. Coste del asma en pediatría en
España: un modelo de costes basado en la prevalencia. An Pediatr.
2011;74:145-53
11. Plaza-Moral V. Farmaeconomía del asma. Med Clin Monogr 2002;3
Supl 1:49–53.
12. GINA. Global Iniciative for Asthma. Global strategy for asthma
management and prevention NHBLI/WHO Workshop Report. 2012;
Disponible en htpp:/http://www.ginasthma.com.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
94
13. Fueyo A, Ruiz MA, Ancochea J, Guilera M, Badia X, on behalf of the
ESCASE Group. Asthma control in Spain. Do season and treatment pattern
matter? The ESCASE study. Respiratory medicine. 2007;101(5):919-24.
14. Reddel HK, Taylor DR, Bateman ED, Boulet LP, Boushey HA, Busse
WW, Casale TB, Chanez P, Enright PL, Gibson PG, de Jongste JC, Kerstjens
HA, Lazarus SC, Levy ML, O'Byrne PM, Partridge MR, Pavord ID, Sears MR,
Sterk PJ, Stoloff SW, Sullivan SD, Szefler SJ, Thomas MD, Wenzel SE.
American Thoracic Society/European Respiratory Society Task Force on
Asthma Control and Exacerbations. An official American Thoracic
Society/European Respiratory Society statement: asthma control and
exacerbations: standardizing endpoints for clinical asthma trials and clinical
practice. Am J Respir Crit Care Med. 2009;1;180(1):59-99
15. Barranco P, Quirce S. Conceptos y definiciones. Evaluación
sistemática del asma grave no controlada. Asma grave, Barranco P, Quirce
S (Eds) Luzán 5 (Ed) (ISBN: 978-84-7989-759-8). 2013; 7-23.
16. O'Byrne PM1, Barnes PJ, Rodriguez-Roisin R, Runnerstrom E,
Sandstrom T, Svensson K, Tattersfield A. Low dose inhaled budesonide and
formoterol in mild persistent asthma: the OPTIMA randomized trial. Am J
Respir Crit Care Med. 2001; 15;164 (8 Pt 1):1392-7.
17. Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev
Genet. 2010;11(1):31-46.
18. Johnson GC1, Esposito L, Barratt BJ, Smith AN, Heward J, Di Genova
G, Ueda H, Cordell HJ, Eaves IA, Dudbridge F, Twells RC, Payne F, Hughes
W, Nutland S, Stevens H, Carr P, Tuomilehto-Wolf E, Tuomilehto J, Gough
SC, Clayton DG, Todd JA. Haplotype tagging for the identification of
common disease genes. Nat genet. 2001;29(2):233-7.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
95
19. Montpetit A, Nelis M, Laflamme P, Magi R, Ke X, Remm M, Cardon L,
Hudson T, Metspalu A. An evaluation of the performance of tag SNPs
derived from HapMap in a Caucasian population. PLoS genet.
2006;2(3):e27.
20. Bosse Y, Hudson TJ. Toward a comprehensive set of asthma
susceptibility genes. Annu Rev Med. 2007;58:171-84.
21. Ober C, Hoffjan S. Asthma genetics 2006: the long and winding road
to gene discovery. Genes immun. 2006;7(2):95-100.
22. Ober C, Yao TC. The genetics of asthma and allergic disease: a 21st
century perspective. Immunol Rev. 2011;242(1):10-30.
23. Risch N, Merikangas K. The future of genetic studies of complex
human diseases. Science. 1996;273(5281):1516-7.
24. Moffatt MF, Gut IG, Demenais F, Strachan DP, Bouzigon E, Heath S,
von Mutius E, Farrall M, Lathrop M, Cookson WO; GABRIEL Consortium A
large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. N
Engl J Med. 2010;363(13):1211-21.
25. Torgerson DG, Ampleford EJ, Chiu GY, Gauderman WJ, Gignoux CR,
Graves PE, Himes BE, Levin AM, Mathias RA, Hancock DB, Baurley JW, Eng
C, Stern DA, Celedón JC, Rafaels N, Capurso D, Conti DV, Roth LA, Soto-
Quiros M, Togias A, Li X, Myers RA, Romieu I, Van Den Berg DJ, Hu D,
Hansel NN, Hernandez RD, Israel E, Salam MT, Galanter J, Avila PC, Avila L,
Rodriquez-Santana JR, Chapela R, Rodriguez-Cintron W, Diette GB,
Adkinson NF, Abel RA, Ross KD, Shi M, Faruque MU, Dunston GM, Watson
HR, Mantese VJ, Ezurum SC, Liang L, Ruczinski I, Ford JG, Huntsman S,
Chung KF, Vora H, Li X, Calhoun WJ, Castro M, Sienra-Monge JJ, del Rio-
Navarro B, Deichmann KA, Heinzmann A, Wenzel SE, Busse WW, Gern JE,
Lemanske RF Jr, Beaty TH, Bleecker ER, Raby BA, Meyers DA, London SJ;
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
96
Mexico City Childhood Asthma Study (MCAAS), Gilliland FD; Children's
Health Study (CHS) and HARBORS study, Burchard EG; Genetics of Asthma
in Latino Americans (GALA) Study, Study of Genes-Environment and
Admixture in Latino Americans (GALA2) and Study of African Americans,
Asthma, Genes & Environments (SAGE), Martinez FD; Childhood Asthma
Research and Education (CARE) Network, Weiss ST; Childhood Asthma
Management Program (CAMP), Williams LK; Study of Asthma Phenotypes
and Pharmacogenomic Interactions by Race-Ethnicity (SAPPHIRE), Barnes
KC; Genetic Research on Asthma in African Diaspora (GRAAD) Study, Ober
C, Nicolae DLl. Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma
in ethnically diverse North American populations. Nat Genet.
2011;43(9):887-92.
26. Wang WY, Barratt BJ, Clayton DG, Todd JA. Genome-wide association
studies: theoretical and practical concerns. Nat Rev Genet. 2005;6(2):109-
18.
27. Manolio TA, Collins FS, Cox NJ, Goldstein DB, Hindorff LA, Hunter DJ,
McCarthy MI, Ramos EM, Cardon LR, Chakravarti A, Cho JH, Guttmacher
AE, Kong A, Kruglyak L, Mardis E, Rotimi CN, Slatkin M, Valle D, Whittemore
AS, Boehnke M, Clark AG, Eichler EE, Gibson G, Haines JL, Mackay TF,
McCarroll SA, Visscher PM. Finding the missing heritability of complex
diseases. Nature. 2009;461(7265):747-53.
28. Lee SH, Wray NR, Goddard ME, Visscher PM. Estimating missing
heritability for disease from genome-wide association studies. Am J Hum
Genet. 2011;88(3):294-305.
29. Eichler EE, Flint J, Gibson G, Kong A, Leal SM, Moore JH, Nadeau JH.
Missing heritability and strategies for finding the underlying causes of
complex disease. Nat Rev Genet. 2010;11(6):446-50.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
97
30. Pritchard JK. Are rare variants responsible for susceptibility to
complex diseases? Am J Hum Genet. 2001;69(1):124-37.
31. Allen M, Heinzmann A, Noguchi E, Abecasis G, Broxholme J, Ponting
CP, Bhattacharyya S, Tinsley J, Zhang Y, Holt R, Jones EY, Lench N, Carey
A, Jones H, Dickens NJ, Dimon C, Nicholls R, Baker C, Xue L, Townsend E,
Kabesch M, Weiland SK, Carr D, von Mutius E, Adcock IM, Barnes PJ,
Lathrop GM, Edwards M, Moffatt MF, Cookson WO. Positional cloning of a
novel gene influencing asthma from chromosome 2q14. Nat Genet.
2003;35(3):258-63.
32. Van Eerdewegh P1, Little RD, Dupuis J, Del Mastro RG, Falls K, Simon
J, Torrey D, Pandit S, McKenny J, Braunschweiger K, Walsh A, Liu Z,
Hayward B, Folz C, Manning SP, Bawa A, Saracino L, Thackston M,
Benchekroun Y, Capparell N, Wang M, Adair R, Feng Y, Dubois J, FitzGerald
MG, Huang H, Gibson R, Allen KM, Pedan A, Danzig MR, Umland SP, Egan
RW, Cuss FM, Rorke S, Clough JB, Holloway JW, Holgate ST, Keith TP.
Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial
hyperresponsiveness. Nature. 2002;418(6896):426-30.
33. Postma DS, Howard T. ADAM33 gene: confirming a gene without
linkage. Clin Exp Allergy. 2004;34(1):1-3.
34. Schedel M, Depner M, Schoen C, Weiland SK, Vogelberg C,
Niggemann B, Lau S, Illig T, Klopp N, Wahn U, von Mutius E, Nickel R,
Kabesch M. The role of polymorphisms in ADAM33, a disintegrin and
metalloprotease 33, in childhood asthma and lung function in two German
populations. Resp Res. 2006;7:91.
35. Daniels SE, Bhattacharrya S, James A, Leaves NI, Young A, Hill MR,
Faux JA, Ryan GF, le Söuef PN, Lathrop GM, Musk AW, Cookson WO. A
genome-wide search for quantitative trait loci underlying asthma. Nature.
1996;383(6597):247-50.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
98
36. Laitinen T, Daly MJ, Rioux JD, Kauppi P, Laprise C, Petäys T, Green T,
Cargill M, Haahtela T, Lander ES, Laitinen LA, Hudson TJ, Kere J. A
susceptibility locus for asthma-related traits on chromosome 7 revealed by
genome-wide scan in a founder population. Nat Genet. 2001;28(1):87-91.
37. Leaves NI, Bhattacharyya S, Wiltshire S, Cookson WO. A detailed
genetic map of the chromosome 7 bronchial hyper-responsiveness locus.
Eur J Hum Genet. 2002;10(3):177-82.
38. Laitinen T, Polvi A, Rydman P, Vendelin J, Pulkkinen V, Salmikangas
P, Mäkelä S, Rehn M, Pirskanen A, Rautanen A, Zucchelli M, Gullstén H,
Leino M, Alenius H, Petäys T, Haahtela T, Laitinen A, Laprise C, Hudson TJ,
Laitinen LA, Kere J. Characterization of a common susceptibility locus for
asthma-related traits. Science. 2004;304(5668):300-4.
39. Koppelman GH, Meyers DA, Howard TD, Zheng SL, Hawkins GA,
Ampleford EJ, Xu J, Koning H, Bruinenberg M, Nolte IM, van Diemen CC,
Boezen HM, Timens W, Whittaker PA, Stine OC, Barton SJ, Holloway JW,
Holgate ST, Graves PE, Martinez FD, van Oosterhout AJ, Bleecker ER,
Postma DS. Identification of PCDH1 as a novel susceptibility gene for
bronchial hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med.
2009;180(10):929-35.
40. Becker KG, Barnes KC, Bright TJ, Wang SA. The genetic association
database. Nat Genet. 2004;36(5):431-2.
41. Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao Y, Liao H, Lee SP,
Goudie DR, Sandilands A, Campbell LE, Smith FJ, O'Regan GM, Watson RM,
Cecil JE, Bale SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ, Fleckman P, Lewis-Jones S,
Arseculeratne G, Sergeant A, Munro CS, El Houate B, McElreavey K,
Halkjaer LB, Bisgaard H, Mukhopadhyay S, McLean WH. Common loss-of-
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
99
function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major
predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet. 2006;38(4):441-6.
42. Rogers AJ, Celedon JC, Lasky-Su JA, Weiss ST, Raby BA. Filaggrin
mutations confer susceptibility to atopic dermatitis but not to asthma. J
Allergy Clin Immunol. 2007;120(6):1332-7.
43. Moffatt MF, Kabesch M, Liang L, Dixon AL, Strachan D, Heath S,
Depner M, von Berg A, Bufe A, Rietschel E, Heinzmann A, Simma B, Frischer
T, Willis-Owen SA, Wong KC, Illig T, Vogelberg C, Weiland SK, von Mutius E,
Abecasis GR, Farrall M, Gut IG, Lathrop GM, Cookson WO. Genetic variants
regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma.
Nature. 2007;448(7152):470-3.
44. Galanter J, Choudhry S, Eng C, Nazario S, Rodriguez-Santana JR,
Casal J, Torres-Palacios A, Salas J, Chapela R, Watson HG, Meade K, LeNoir
M, Rodríguez-Cintrón W, Avila PC, Burchard EG. ORMDL3 gene is associated
with asthma in three ethnically diverse populations. Am J Respir Crit Care
Med. 2008;177(11):1194-200.
45. Bisgaard H, Bønnelykke K, Sleiman PM, Brasholt M, Chawes B,
Kreiner-Møller E, Stage M, Kim C, Tavendale R, Baty F, Pipper CB, Palmer
CN, Hakonarsson H. Chromosome 17q21 gene variants are associated with
asthma and exacerbations but not atopy in early childhood. Am J Respir Crit
Care Med. 2009;179(3):179-85.
46. Bouzigon E, Corda E, Aschard H, Dizier MH, Boland A, Bousquet J,
Chateigner N, Gormand F, Just J, Le Moual N, Scheinmann P, Siroux V,
Vervloet D, Zelenika D, Pin I, Kauffmann F, Lathrop M, Demenais F. Effect
of 17q21 variants and smoking exposure in early-onset asthma. N Engl J
Med. 2008;359(19):1985-94.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
100
47. Madore AM, Tremblay K, Hudson TJ, Laprise C. Replication of an
association between 17q21 SNPs and asthma in a French-Canadian familial
collection. Hum Genet. 2008;123(1):93-5.
48. Sleiman PM, Annaiah K, Imielinski M, Bradfield JP, Kim CE, Frackelton
EC, Glessner JT, Eckert AW, Otieno FG, Santa E, Thomas K, Smith RM,
Glaberson W, Garris M, Gunnlaugsson S, Chiavacci RM, Allen J, Spergel J,
Grundmeier R, Grunstein MM, Magnusson M, Bisgaard H, Grant SF,
Hakonarson H. ORMDL3 variants associated with asthma susceptibility in
North Americans of European ancestry. J Allergy Clin Immunol.
2008;122(6):1225-7.
49. Tavendale R, Macgregor DF, Mukhopadhyay S, Palmer CN. A
polymorphism controlling ORMDL3 expression is associated with asthma
that is poorly controlled by current medications. J Allergy Clin Immunol.
2008;121(4):860-3.
50. Halapi E, Gudbjartsson DF, Jonsdottir GM, Bjornsdottir US,
Thorleifsson G, Helgadottir H, Williams C, Koppelman GH, Heinzmann A,
Boezen HM, Jonasdottir A, Blondal T, Gudjonsson SA, Jonasdottir A,
Thorlacius T, Henry AP, Altmueller J, Krueger M, Shin HD, Uh ST, Cheong
HS, Jonsdottir B, Ludviksson BR, Ludviksdottir D, Gislason D, Park CS,
Deichmann K, Thompson PJ, Wjst M, Hall IP, Postma DS, Gislason T, Kong
A, Jonsdottir I, Thorsteinsdottir U, Stefansson K. A sequence variant on
17q21 is associated with age at onset and severity of asthma. Eur J Hum
Genet. 2010;18(8):902-8.
51. Hirota T, Harada M, Sakashita M, Doi S, Miyatake A, Fujita K,
Enomoto T, Ebisawa M, Yoshihara S, Noguchi E, Saito H, Nakamura Y,
Tamari M. Genetic polymorphism regulating ORM1-like 3 (Saccharomyces
cerevisiae) expression is associated with childhood atopic asthma in a
Japanese population. J Allergy Clin Immunol. 2008;121(3):769-70.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
101
52. Leung TF, Sy HY, Ng MC, Chan IH, Wong GW, Tang NL, Waye MM,
Lam CW. Asthma and atopy are associated with chromosome 17q21
markers in Chinese children. Allergy. 2009;64(4):621-8.
53. Kobilka BK, Dixon RA, Frielle T, Dohlman HG, Bolanowski MA, Sigal
IS, Yang-Feng TL, Francke U, Caron MG, Lefkowitz RJ. cDNA for the human
beta 2-adrenergic receptor: a protein with multiple membrane-spanning
domains and encoded by a gene whose chromosomal location is shared with
that of the receptor for platelet-derived growth factor. Proc Natl Acad Sci U
S A. 1987;84(1):46-50.
54. Israel E, Drazen JM, Liggett SB, Boushey HA, Cherniack RM, Chinchilli
VM, Cooper DM, Fahy JV, Fish JE, Ford JG, Kraft M, Kunselman S, Lazarus
SC, Lemanske RF, Martin RJ, McLean DE, Peters SP, Silverman EK, Sorkness
CA, Szefler SJ, Weiss ST, Yandava CN. The effect of polymorphisms of the
beta(2)-adrenergic receptor on the response to regular use of albuterol in
asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2000;162(1):75-80.
55. Tan S, Hall IP, Dewar J, Dow E, Lipworth B. Association between beta
2-adrenoceptor polymorphism and susceptibility to bronchodilator
desensitisation in moderately severe stable asthmatics. Lancet.
1997;350(9083):995-9.
56. Turki J, Pak J, Green SA, Martin RJ, Liggett SB. Genetic
polymorphisms of the beta 2-adrenergic receptor in nocturnal and
nonnocturnal asthma. Evidence that Gly16 correlates with the nocturnal
phenotype. J Clin Invest. 1995;95(4):1635-41.
57. Hall IP, Blakey JD, Al Balushi KA, Wheatley A, Sayers I, Pembrey ME,
Ring SM, McArdle WL, Strachan DP. Beta2-adrenoceptor polymorphisms and
asthma from childhood to middle age in the British 1958 birth cohort: a
genetic association study. Lancet. 2006;368(9537):771-9.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
102
58. Dewar JC, Wilkinson J, Wheatley A, Thomas NS, Doull I, Morton N,
Lio P, Harvey JF, Liggett SB, Holgate ST, Hall IP. The glutamine 27 beta2-
adrenoceptor polymorphism is associated with elevated IgE levels in
asthmatic families. J Allergy Clin Immunol. 1997;100(2):261-5.
59. Joseph CL, Williams LK, Ownby DR, Saltzgaber J, Johnson CC.
Applying epidemiologic concepts of primary, secondary, and tertiary
prevention to the elimination of racial disparities in asthma. J Allergy Clin
Immunol. 2006;117(2):233-40; quiz 41-2.
60. Burchard EG, Silverman EK, Rosenwasser LJ, Borish L, Yandava C,
Pillari A, iss ST, Hasday J, Lilly CM, Ford JG, Drazen JM. Association between
a sequence variant in the IL-4 gene promoter and FEV(1) in asthma. Am J
Respir Crit Care Med. 1999;160(3):919-22.
61. Zhu S, Chan-Yeung M, Becker AB, Dimich-Ward H, Ferguson AC,
Manfreda J, tson WT, Paré PD, Sandford AJ. Polymorphisms of the IL-4,
TNF-alpha, and Fcepsilon RIbeta genes and the risk of allergic disorders in
at-risk infants. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161(5):1655-9.
62. Sandford AJ, Chagani T, Zhu S, Weir TD, Bai TR, Spinelli JJ,
Fitzgerald JM, Behbehani NA, Tan WC, Paré PD. Polymorphisms in the IL4,
IL4RA, and FCERIB genes and asthma severity. J Allergy Clin Immunol.
2000;106(1 Pt 1):135-40.
63. Beghe B, Barton S, Rorke S, Peng Q, Sayers I, Gaunt T, Keith TP,
Clough JB, Holgate ST, Holloway JW. Polymorphisms in the interleukin-4
and interleukin-4 receptor alpha chain genes confer susceptibility to asthma
and atopy in a Caucasian population. Clin Exp Allergy. 2003;33(8):1111-7.
64. Kabesch M, Tzotcheva I, Carr D, Hofler C, Weiland SK, Fritzsch C, von
Mutius E, Martinez FD. A complete screening of the IL4 gene: novel
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
103
polymorphisms and their association with asthma and IgE in childhood. J
Allergy Clin Immunol. 2003;112(5):893-8.
65. Basehore MJ, Howard TD, Lange LA, Moore WC, Hawkins GA, Marshik
PL, Harkins MS, Meyers DA, Bleecker ER. A comprehensive evaluation of IL4
variants in ethnically diverse populations: association of total serum IgE
levels and asthma in white subjects. J Allergy Clin Immunol.
2004;114(1):80-7.
66. Walley AJ, Cookson WO. Investigation of an interleukin-4 promoter
polymorphism for associations with asthma and atopy. J Med Genet.
1996;33(8):689-92.
67. Hirschhorn JN, Daly MJ. Genome-wide association studies for
common diseases and complex traits. Nat Rev Genet. 2005;6(2):95-108.
68. Ober C, Tan Z, Sun Y, Possick JD, Pan L, Nicolae R, Radford S, Parry
RR, Heinzmann A, Deichmann KA, Lester LA, Gern JE, Lemanske RF Jr,
Nicolae DL, Elias JA, Chupp GL. Effect of variation in CHI3L1 on serum YKL-
40 level, risk of asthma, and lung function. N Engl J Med.
2008;358(16):1682-91.
69. Weidinger S, Gieger C, Rodriguez E, Baurecht H, Mempel M, Klopp N,
Gohlke H, Wagenpfeil S, Ollert M, Ring J, Behrendt H, Heinrich J, Novak N,
Bieber T, Krämer U, Berdel D, von Berg A, Bauer CP, Herbarth O, Koletzko
S, Prokisch H, Mehta D, Meitinger T, Depner M, von Mutius E, Liang L,
Moffatt M, Cookson W, Kabesch M, Wichmann HE, Illig T. Genome-wide
scan on total serum IgE levels identifies FCER1A as novel susceptibility
locus. PLoS genet. 2008;4(8):e1000166.
70. Sleiman PM, Flory J, Imielinski M, Bradfield JP, Annaiah K, Willis-
Owen SA, Wang K, Rafaels NM, Michel S, Bonnelykke K, Zhang H, Kim CE,
Frackelton EC, Glessner JT, Hou C, Otieno FG, Santa E, Thomas K, Smith
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
104
RM, Glaberson WR, Garris M, Chiavacci RM, Beaty TH, Ruczinski I, Orange
JS, Allen J, Spergel JM, Grundmeier R, Mathias RA, Christie JD, von Mutius
E, Cookson WO, Kabesch M, Moffatt MF, Grunstein MM, Barnes KC, Devoto
M, Magnusson M, Li H, Grant SF, Bisgaard H, Hakonarson H. Variants of
DENND1B associated with asthma in children. N Engl J Med.
2010;362(1):36-44.
71. Hancock DB, Romieu I, Shi M, ienra-Monge JJ, Wu H, Chiu GY, Li H,
del Rio-Navarro BE, Willis-Owen SA, Weiss ST, Raby BA, Gao H, Eng C,
Chapela R, Burchard EG, Tang H, Sullivan PF, London SJ. Genome-wide
association study implicates chromosome 9q21.31 as a susceptibility locus
for asthma in mexican children. PLoS Genet. 2009;5(8):e1000623.
72. Drazen JM, Israel E, O'Byrne PM. Treatment of asthma with drugs
modifying the leukotriene pathway. N Engl J Med. 1999;340(3):197-206.
73. Peters-Golden M, Brock TG. 5-lipoxygenase and FLAP. Prostaglandins
Leukot Essent Fatty Acids. 2003;69(2-3):99-109.
74. Uozumi N, Kume K, Nagase T, Nakatani N, Ishii S, Tashiro F,
Komagata Y, Maki K, Ikuta K, Ouchi Y, Miyazaki J, Shimizu T. Role of
cytosolic phospholipase A2 in allergic response and parturition. Nature.
1997;390(6660):618-22.
75. Henderson WR Jr, Chi EY, Bollinger JG, Tien YT, Ye X, Castelli L,
Rubtsov YP, Singer AG, Chiang GK, Nevalainen T, Rudensky AY, Gelb MH.
Importance of group X-secreted phospholipase A2 in allergen-induced
airway inflammation and remodeling in a mouse asthma model. J Exp Med.
2007;204(4):865-77.
76. Luo M, Jones SM, Phare SM, Coffey MJ, Peters-Golden M, Brock TG.
Protein kinase A inhibits leukotriene synthesis by phosphorylation of 5-
lipoxygenase on serine 523. J Biol Chem. 2004;279(40):41512-20.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
105
77. Coffey MJ, Phare SM, Peters-Golden M. Prolonged exposure to
lipopolysaccharide inhibits macrophage 5-lipoxygenase metabolism via
induction of nitric oxide synthesis. J Immunol. 2000;165(7):3592-8.
78. Luo M, Jones SM, Peters-Golden M, Brock TG. Nuclear localization of
5-lipoxygenase as a determinant of leukotriene B4 synthetic capacity. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2003;100(21):12165-70.
79. Mayatepek E. Leukotriene C4 synthesis deficiency: a member of a
probably underdiagnosed new group of neurometabolic diseases. Eur J
Pediatr. 2000;159(11):811-8.
80. In KH, Asano K, Beier D, Grobholz J, Finn PW, Silverman EK,
Silverman ES, Collins T, Fischer AR, Keith TP, Serino K, Kim SW, De Sanctis
GT, Yandava C, Pillari A, Rubin P, Kemp J, Israel E, Busse W, Ledford D,
Murray JJ, Segal A, Tinkleman D, Drazen JM. Naturally occurring mutations
in the human 5-lipoxygenase gene promoter that modify transcription factor
binding and reporter gene transcription. J Clin Invest. 1997;99(5):1130-7.
81. Helgadottir A, Manolescu A, Thorleifsson G, Gretarsdottir S, Jonsdottir
H, Thorsteinsdottir U, Samani NJ, Gudmundsson G, Grant SF, Thorgeirsson
G, Sveinbjornsdottir S, Valdimarsson EM, Matthiasson SE, Johannsson H,
Gudmundsdottir O, Gurney ME, Sainz J, Thorhallsdottir M, Andresdottir M,
Frigge ML, Topol EJ, Kong A, Gudnason V, Hakonarson H, Gulcher JR,
Stefansson K. The gene encoding 5-lipoxygenase activating protein confers
risk of myocardial infarction and stroke. Nat Genet. 2004;36(3):233-9.
82. Helgadottir A, Manolescu A, Helgason A, Thorleifsson G,
Thorsteinsdottir U, Gudbjartsson DF, Gretarsdottir S, Magnusson KP,
Gudmundsson G, Hicks A, Jonsson T, Grant SF, Sainz J, O'Brien SJ,
Sveinbjornsdottir S, Valdimarsson EM, Matthiasson SE, Levey AI, Abramson
JL, Reilly MP, Vaccarino V, Wolfe ML, Gudnason V, Quyyumi AA, Topol EJ,
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
106
Rader DJ, Thorgeirsson G, Gulcher JR, Hakonarson H, Kong A, Stefansson
K. A variant of the gene encoding leukotriene A4 hydrolase confers
ethnicity-specific risk of myocardial infarction. Nat Genet. 2006;38(1):68-
74.
83. Sanak M, Simon HU, Szczeklik A. Leukotriene C4 synthase promoter
polymorphism and risk of aspirin-induced asthma. Lancet.
1997;350(9091):1599-600.
84. Cowburn AS, Holgate ST, Sampson AP. IL-5 increases expression of
5-lipoxygenase-activating protein and translocates 5-lipoxygenase to the
nucleus in human blood eosinophils. J Immunol. 1999;163(1):456-65.
85. Hsieh FH, Lam BK, Penrose JF, Austen KF, Boyce JA. T helper cell
type 2 cytokines coordinately regulate immunoglobulin E-dependent
cysteinyl leukotriene production by human cord blood-derived mast cells:
profound induction of leukotriene C(4) synthase expression by interleukin 4.
J Exp Med. 2001;193(1):123-33.
86. Serio KJ, Johns SC, Luo L, Hodulik CR, Bigby TD. Lipopolysaccharide
down-regulates leukotriene C4 synthase gene expression in a cell-specific
manner in the monocyte-like cell line, THP-1. Chest. 2003;123(3
Suppl):426S.
87. Davies DE, Wicks J, Powell RM, Puddicombe SM, Holgate ST. Airway
remodeling in asthma: new insights. J Allergy Clin Immunol.
2003;111(2):215-25; quiz 26.
88. Holgate ST, Davies DE, Puddicombe S, Richter A, Lackie P, Lordan J,
Howarth P. Mechanisms of airway epithelial damage: epithelial-
mesenchymal interactions in the pathogenesis of asthma. Eur Respir J
Suppl. 2003;44:24s-9s.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
107
89. Sampson AP, Castling DP, Green CP, Price JF. Persistent increase in
plasma and urinary leukotrienes after acute asthma. Arch Dis Child.
1995;73(3):221-5.
90. Pavord ID, Ward R, Woltmann G, Wardlaw AJ, Sheller JR, Dworski R.
Induced sputum eicosanoid concentrations in asthma. Am J Respir Crit Care
Med. 1999;160(6):1905-9.
91. Laitinen A, Lindqvist A, Halme M, Altraja A, Laitinen LA. Leukotriene
E(4)-induced persistent eosinophilia and airway obstruction are reversed by
zafirlukast in patients with asthma. J Allergy Clin Immunol.
2005;115(2):259-65.
92. Fahrenholz JM. Natural history and clinical features of aspirin-
exacerbated respiratory disease. Clin Rev Allergy Immunol.
2003;24(2):113-24.
93. Berges-Gimeno MP, Simon RA, Stevenson DD. The natural history
and clinical characteristics of aspirin-exacerbated respiratory disease. Ann
Allergy Asthma Immunol. 2002;89(5):474-8.
94. Samter M, Beers RF, Jr. Intolerance to aspirin. Clinical studies and
consideration of its pathogenesis. Ann Intern Med. 1968;68(5):975-83.
95. Jenkins C, Costello J, Hodge L. Systematic review of prevalence of
aspirin induced asthma and its implications for clinical practice. BMJ.
2004;328(7437):434.
96. Laitinen LA, Laitinen A, Haahtela T, Vilkka V, Spur BW, Lee TH.
Leukotriene E4 and granulocytic infiltration into asthmatic airways. Lancet.
1993;341(8851):989-90.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
108
97. Dahlen B. Treatment of aspirin-intolerant asthma with
antileukotrienes. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161(2 Pt 2):S137-41.
98. Peters-Golden M, Henderson WR, Jr. Leukotrienes. N Engl J Med.
2007;357(18):1841-54.
99. Bochenek G, Nagraba K, Nizankowska E, Szczeklik A. A controlled
study of 9alpha,11beta-PGF2 (a prostaglandin D2 metabolite) in plasma and
urine of patients with bronchial asthma and healthy controls after aspirin
challenge. J Allergy Clin Immunol. 2003;111(4):743-9.
100. Ferreri NR, Howland WC, Stevenson DD, Spiegelberg HL. Release of
leukotrienes, prostaglandins, and histamine into nasal secretions of aspirin-
sensitive asthmatics during reaction to aspirin. Am Rev Respir Dis.
1988;137(4):847-54.
101. Daffern PJ, Muilenburg D, Hugli TE, Stevenson DD. Association of
urinary leukotriene E4 excretion during aspirin challenges with severity of
respiratory responses. J Allergy Clin Immunol. 1999;104(3 Pt 1):559-64.
102. Cai Y, Bjermer L, Halstensen TS. Bronchial mast cells are the
dominating LTC4S-expressing cells in aspirin-tolerant asthma. Am J Respir
Cell Mol Biol. 2003;29(6):683-93.
103. Cowburn AS, Sladek K, Soja J, Adamek L, Nizankowska E, Szczeklik
A, Lam BK, Penrose JF, Austen FK, Holgate ST, Sampson AP.
Overexpression of leukotriene C4 synthase in bronchial biopsies from
patients with aspirin-intolerant asthma. J Clin Invest. 1998;101(4):834-46.
104. Nasser S, Christie PE, Pfister R, Sousa AR, Walls A, Schmitz-
Schumann M, Lee TH. Effect of endobronchial aspirin challenge on
inflammatory cells in bronchial biopsy samples from aspirin-sensitive
asthmatic subjects. Thorax. 1996;51(1):64-70.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
109
105. Adamjee J, Suh YJ, Park HS, Choi JH, Penrose JF, Lam BK, Austen KF,
Cazaly AM, Wilson SJ, Sampson AP. Expression of 5-lipoxygenase and
cyclooxygenase pathway enzymes in nasal polyps of patients with aspirin-
intolerant asthma. J Pathol. 2006;209(3):392-9.
106. Sousa AR, Parikh A, Scadding G, Corrigan CJ, Lee TH. Leukotriene-
receptor expression on nasal mucosal inflammatory cells in aspirin-sensitive
rhinosinusitis. N Engl J Med. 2002;347(19):1493-9.
107. Ying S, Meng Q, Scadding G, Parikh A, Corrigan CJ, Lee TH. Aspirin-
sensitive rhinosinusitis is associated with reduced E-prostanoid 2 receptor
expression on nasal mucosal inflammatory cells. J Allergy Clin Immunol.
2006;117(2):312-8.
108. Sanak M, Levy BD, Clish CB, Chiang N, Gronert K, Mastalerz L,
Serhan CN, Szczeklik A. Aspirin-tolerant asthmatics generate more lipoxins
than aspirin-intolerant asthmatics. Eur Respir J. 2000;16(1):44-9.
109. Picado C, Fernandez-Morata JC, Juan M, Roca-Ferrer J, Fuentes M,
Xaubet A, Mullol J. Cyclooxygenase-2 mRNA is downexpressed in nasal
polyps from aspirin-sensitive asthmatics. Am J Respir Crit Care Med.
1999;160(1):291-6.
110. Pierzchalska M, Szabo Z, Sanak M, Soja J, Szczeklik A. Deficient
prostaglandin E2 production by bronchial fibroblasts of asthmatic patients,
with special reference to aspirin-induced asthma. J Allergy Clin Immunol.
2003;111(5):1041-8.
111. Sestini P, Armetti L, Gambaro G, Pieroni MG, Refini RM, Sala A, Vaghi
A, Folco GC, Bianco S, Robuschi M. Inhaled PGE2 prevents aspirin-induced
bronchoconstriction and urinary LTE4 excretion in aspirin-sensitive asthma.
Am J Respir Crit Care Med. 1996;153(2):572-5.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
110
112. Israel E, Fischer AR, Rosenberg MA, Lilly CM, Callery JC, Shapiro J,
Cohn J, Rubin P, Drazen JM. The pivotal role of 5-lipoxygenase products in
the reaction of aspirin-sensitive asthmatics to aspirin. Am Rev Respir Dis.
1993;148(6 Pt 1):1447-51.
113. Nasser SM, Bell GS, Foster S, Spruce KE, MacMillan R, Williams AJ,
Lee TH, Arm JP. Effect of the 5-lipoxygenase inhibitor ZD2138 on aspirin-
induced asthma. Thorax. 1994;49(8):749-56.
114. Funk CD, Funk LB, FitzGerald GA, Samuelsson B. Characterization of
human 12-lipoxygenase genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(9):3962-
6.
115. Duroudier NP, Tulah AS, Sayers I. Leukotriene pathway genetics and
pharmacogenetics in allergy. Allergy. 2009;64(6):823-39.
116. Ring WL, Riddick CA, Baker JR, Munafo DA, Bigby TD. Lymphocytes
stimulate expression of 5-lipoxygenase and its activating protein in
monocytes in vitro via granulocyte macrophage colony-stimulating factor
and interleukin 3. J Clin Invest. 1996;97(5):1293-301.
117. Steinhilber D, Brungs M, Radmark O, Samuelsson B. Transforming
growth factor-beta and 1,25-dihydroxyvitamin D3 induce 5-lipoxygenase
activity during myeloid cell maturation. Adv Prostaglandin Thromboxane
Leukot Res. 1995;23:449-51.
118. Haeggström JZ. Structure, function, and regulation of leukotriene A4
hydrolase. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161(2 Pt 2):S25-31.
119. Nicosia S, Capra V, Rovati GE. Leukotrienes as mediators of asthma.
Pulm Pharmacol Ther. 2001;14(1):3-19.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
111
120. Henderson WR, Jr. The role of leukotrienes in inflammation. Ann
Intern Med.. 1994;121(9):684-97.
121. Kalayci O, Birben E, Sackesen C, Keskin O, Tahan F, Wechsler ME,
Civelek E, Soyer OU, Adalioglu G, Tuncer A, Israel E, Lilly C. ALOX5
promoter genotype, asthma severity and LTC production by eosinophils.
Allergy. 2006;61(1):97-103.
122. Rouzer CA, Kargman S. Translocation of 5-lipoxygenase to the
membrane in human leukocytes challenged with ionophore A23187. J Biol
Chem. 1988;263(22):10980-8.
123. Vickers PJ, O'Neill GP, Mancini JA, Charleson S, Abramovitz M. Cross-
species comparison of 5-lipoxygenase-activating protein. Mol Pharmacol.
1992;42(6):1014-9.
124. Tay A, Simon JS, Squire J, Hamel K, Jacob HJ, Skorecki K. Cytosolic
phospholipase A2 gene in human and rat: chromosomal localization and
polymorphic markers. Genomics. 1995;26(1):138-41.
125. Lam BK, Austen KF. Leukotriene C4 synthase: a pivotal enzyme in
cellular biosynthesis of the cysteinyl leukotrienes. Prostaglandins Other Lipid
Mediat. 2002;68-69:511-20.
126. Penrose JF, Spector J, Baldasaro M, Xu K, Boyce J, Arm JP, Austen
KF, Lam BK. Molecular cloning of the gene for human leukotriene C4
synthase. Organization, nucleotide sequence, and chromosomal localization
to 5q35. J Biol Chem. 1996;271(19):11356-61.
127. Mancini JA, Evans JF. Cloning and characterization of the human
leukotriene A4 hydrolase gene. Eur J Biochem. 1995;231(1):65-71.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
112
128. Silverman ES, Du J, De Sanctis GT, Radmark O, Samuelsson B,
Drazen JM, Collins T. Egr-1 and Sp1 interact functionally with the 5-
lipoxygenase promoter and its naturally occurring mutants. Am J Respir Cell
Mol Biol.1998;19(2):316-23.
129. Kawagishi Y, Mita H, Taniguchi M, Maruyama M, Oosaki R, Higashi N,
Kashii T, Kobayashi M, Akiyama K. Leukotriene C4 synthase promoter
polymorphism in Japanese patients with aspirin-induced asthma. J Allergy
Clin Immunol 2002;109(6):936-42.
130. Kim SH, Bae JS, Suh CH, Nahm DH, Holloway JW, Park HS.
Polymorphism of tandem repeat in promoter of 5-lipoxygenase in ASA-
intolerant asthma: a positive association with airway hyperresponsiveness.
Allergy. 2005;60(6):760-5.
131. Sayers I, Barton S, Rorke S, Sawyer J, Peng Q, Beghe B, Ye S, Keith
T, Clough JB, Holloway JW, Sampson AP, Holgate ST. Promoter
polymorphism in the 5-lipoxygenase (ALOX5) and 5-lipoxygenase-activating
protein (ALOX5AP) genes and asthma susceptibility in a Caucasian
population. Clin Exp Allergy 2003;33(8):1103-10.
132. Koshino T, Takano S, Kitani S, Ohshima N, Sano Y, Takaishi T, Hirai
K, Yamamoto K, Morita Y. Novel polymorphism of the 5-lipoxygenase
activating protein (FLAP) promoter gene associated with asthma. Mol Cell
Biol Res Commun. 1999;2(1):32-5.
133. Holloway JW, Barton SJ, Holgate ST, Rose-Zerilli MJ, Sayers I. The
role of LTA4H and ALOX5AP polymorphism in asthma and allergy
susceptibility. Allergy. 2008;63(8):1046-53.
134. Kedda MA, Shi J, Duffy D, Phelps S, Yang I, O'Hara K, Fong K,
Thompson PJ. Characterization of two polymorphisms in the leukotriene C4
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
113
synthase gene in an Australian population of subjects with mild, moderate,
and severe asthma. J Allergy Clin Immunol. 2004;113(5):889-95.
135. Sampson AP, Siddiqui S, Buchanan D, Howarth PH, Holgate ST,
Holloway JW, Sayers I. Variant LTC(4) synthase allele modifies cysteinyl
leukotriene synthesis in eosinophils and predicts clinical response to
zafirlukast. Thorax. 2000;55 Suppl 2:S28-31.
136. Sayers I, Barton S, Rorke S, Beghe B, Hayward B, Van Eerdewegh P,
Keith T, Clough JB, Ye S, Holloway JW, Sampson AP, Holgate ST. Allelic
association and functional studies of promoter polymorphism in the
leukotriene C4 synthase gene (LTC4S) in asthma. Thorax. 2003;58(5):417-
24.
137. Bateman ED, Hurd SS, Barnes PJ, Bousquet J, Drazen JM, FitzGerald
M, Gibson P, Ohta K, O'Byrne P, Pedersen SE, Pizzichini E, Sullivan SD,
Wenzel SE, Zar HJ. Global strategy for asthma management and
prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 2008;31(1):143-78.
138. Masoli M, Fabian D, Holt S, Beasley R, Global Initiative for Asthma
(GINA) Program. The global burden of asthma: executive summary of the
GINA Dissemination Committee report. Allergy. 2004;59(5):469-78.
139. Braman SS. The global burden of asthma. Chest. 2006;130(1
Suppl):4S-12S.
140. 2006. wHOWfA. Available from http: //www.who.int/mediacenter
//fs307/en/index.html. (cited 2008 november 11);.
141. Holloway JW, Yang IA, Holgate ST. Genetics of allergic disease. J
Allergy Clin Immunol. 2010;125(2 Suppl 2):S81-94.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
114
142. De Caterina R, Zampolli A. From asthma to atherosclerosis--5-
lipoxygenase, leukotrienes, and inflammation. N Engl J Med. 2004;
350(1):4-7.
143. Hoshiko S, Radmark O, Samuelsson B. Characterization of the human
5-lipoxygenase gene promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(23):
9073-7.
144. Garner MM, Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying
the binding of proteins to specific DNA regions: application to components
of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res.
1981;9(13):3047-60.
145. Fried M, Crothers DM. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator
interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res.
1981;9(23):6505-25.
146. Vikman S, Brena RM, Armstrong P, Hartiala J, Stephensen CB,
Allayee H. Functional analysis of 5-lipoxygenase promoter repeat variants.
Hum Mol Genet. 2009;18(23):4521-9.
147. Mougey E, Lang JE, Allayee H, Teague WG, Dozor AJ, Wise RA, Lima
JJ. ALOX5 polymorphism associates with increased leukotriene production
and reduced lung function and asthma control in children with poorly
controlled asthma. Clin Exp Allergy. 2013;43(5):512-20.
148. Lima JJ, Zhang S, Grant A, Shao L, Tantisira KG, Allayee H, Wang J,
Sylvester J, Holbrook J, Wise R, Weiss ST, Barnes K. Influence of
leukotriene pathway polymorphisms on response to montelukast in asthma.
Am J Respir Crit Care Med. 2006;173(4):379-85.
149. Drazen JM, Yandava CN, Dube L, Szczerback N, Hippensteel R, Pillari
A, Israel E, Schork N, Silverman ES, Katz DA, Drajesk J. Pharmacogenetic
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
115
association between ALOX5 promoter genotype and the response to anti-
asthma treatment. Nat Genet. 1999;22(2):168-70.
150. Telleria JJ, Blanco-Quiros A, Varillas D, Armentia A, Fernandez-
Carvajal I, Jesus Alonso M, Diez I. ALOX5 promoter genotype and response
to montelukast in moderate persistent asthma. Respir Med. 2008;
102(6):857-61.
151. Kennedy BP, Diehl RE, Boie Y, Adam M, Dixon RA. Gene
characterization and promoter analysis of the human 5-lipoxygenase-
activating protein (FLAP). J Biol Chem. 1991;266(13):8511-6.
152. Yandava CN, Kennedy BP, Pillari A, Duncan AM, Drazen JM.
Cytogenetic and radiation hybrid mapping of human arachidonate 5-
lipoxygenase-activating protein (ALOX5AP) to chromosome 13q12.
Genomics. 1999;56(1):131-3.
153. Kedda MA, Worsley P, Shi J, Phelps S, Duffy D, Thompson PJ.
Polymorphisms in the 5-lipoxygenase activating protein (ALOX5AP) gene
are not associated with asthma in an Australian population. Clin Exp Allergy
2005;35(3):332-8.
154. Bleecker ER. Mapping susceptibility genes for asthma and allergy.
Clin Exp Allergy. 1998;28 Suppl 5:6-12; discussion 26-8.
155. Sanak M, Pierzchalska M, Bazan-Socha S, Szczeklik A. Enhanced
expression of the leukotriene C(4) synthase due to overactive transcription
of an allelic variant associated with aspirin-intolerant asthma. Am J Respir
Cell Mol Biol. 2000;23(3):290-6.
156. Bauer J, Amelung P, Meyers D. Association of asthma susceptibility
and severity with a polymorphism in the leukotriene C4 (LTC4) synthase
gene. Am J Respir Crit Care Med 1999;159:A650–A.
Tesis Doctoral
José Ángel Cumplido Bonny Universidad de Las Palmas
116
157. Kim HB, Lee SY, Shim JY, Kim JH, Kang MJ, Hong SJ. The leukotriene
C4 synthase (A-444C) promoter polymorphism is associated with the
severity of exercise-induced asthma in Korean children. J Allergy Clin
Immunol. 2006;117(5):1191-2.
158. Isidoro-García M, Davila I, Moreno E, Laffond E, Lorente F, González-
Sarmiento R. Analysis of the leukotriene C4 synthase A-444C promoter
polymorphism in a Spanish population. J Allergy Clin Immunol. 2005;
115(1):206-7.
159. Zhang Y, Huang H, Huang J, Xiang Z, Yang M, Tian C, Fan H. The -
444A/C polymorphism in the LTC4S gene and the risk of asthma: a meta-
analysis. Arch Med Res. 2012;43(6):444-50.
FIG 1. ORs and their 95% CIs for the SNPs rs1624395 and rs1370128 in the
sequential addition of atopic asthma cases according to age at diagnosis.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME 129, NUMBER 2
LETTERS TO THE EDITOR 573
IL-1 receptor–associated kinase 3 gene (IRAK3)variants associate with asthma in a replicationstudy in the Spanish population
To the Editor:Asthma is a chronic inflammatory disease associated with
genetic and environmental factors. Although the 12q13-24chromosome region had previously shown linkage to asthma,the IL-1 receptor–associated kinase 3 gene (IRAK3) has recentlyemerged as a susceptibility candidate for asthma as a result ofpositional cloning of persistent asthma with age of onset lessthan 13 years in Italian samples.1 IRAK3 encodes a proteinthat negatively regulates Toll-like receptor signaling pathwaysinvolved in innate host defense and in the control of adaptive im-mune responses. However, single nucleotide polymorphisms(SNPs) near IRAK3 have not reached the stringent significancethresholds in any of the genome-wide association studies(GWASs) performed in asthmatic patients.2 Here we aimed toreplicate the association of IRAK3 genetic variants with suscep-tibility to asthma in a case-control study with unrelated Spanishsubjects.For this purpose, DNA samples from 607 patients aged 5 years
or older with physician-diagnosed asthma and fulfilling theGlobal Initiative for Asthma guidelines (www.ginasthma.com)were collected from respiratorymedicine and allergy departmentsas part of the Genetics of Asthma (GOA) study in the Spanishpopulation. Samples from 1271 nonasthmatic patients without apersonal or familial history of allergic or pulmonary diseaseswere obtained from the Spanish National DNA Biobank (www.bancoadn.org), and these were used as control samples. Furthersample details can be found in the Methods section and TableE1 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org.
Fifteen tagging SNPs (tSNPs) were selected and genotyped,as described elsewhere,3 to comprehensively survey commongene variation. All of them passed our quality control filtersand were considered for the analyses (see the Methods sectionand Table E2 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org). Additionally, 83 European ancestry informativemarkers (EuroAIMs; see Table E3 in this article’s Online Re-pository at www.jacionline.org) were genotyped and used forprincipal component analysis with EIGENSOFT to derive thescores for the first principal component (PC1).4 Association ofindividual tSNPs was tested with the Cochran-Armitage trendtest, and then a logistic regression analysis was used to calculateodds ratios (ORs) with 95% CIs and to adjust for populationstratification by using the PC1 scores. Additionally, 15 untypedSNPs of the gene were imputed and tested for association. Hap-lotype associations were also tested to replicate previous find-ings.1 A false discovery rate (FDR) threshold of 5% wasestablished to limit the expected proportion of false-positive re-sults incurred in the study when a particular subject’s SNP testresult was considered significant. Further method details are de-scribed in the Methods section in this article’s OnlineRepository.For asthma, only 1 SNP (rs1168774) was nominally associated
but was not considered significant in the context of the multipletests performed (P 5 .038, FDR 5 42%, see Table E4 in this ar-ticle’s Online Repository at www.jacionline.org). However, 4tSNPs showed nominal association with atopic asthma (seeTable E4 for unadjusted results), 3 of them remaining significantafter adjusting for population stratification: rs1732877 (OR, 1.24;
95% CI, 1.04-1.46; P 5 .014), rs1624395 (OR, 1.22; 95% CI,1.03-1.45; P 5 .019), and rs1370128 (OR, 1.22; 95% CI, 1.03-1.44; P5 .019). Testing of untyped variants revealed 8 additionalSNPswith nominal association with atopic asthma (.014 <_P value<_ .048, see Table E4). All 11 SNPs were considered significantlyassociated with atopic asthma (FDR 5 2%) and showedmoderate-to-strong linkage disequilibrium (LD; 0.48 <_ r2 <_1.0). Three of them replicated previous findings (rs1624395,rs1370128, and rs2293657).1
A previous study suggested that association of IRAK3 withasthma varied with the age of onset.1 Analyzing the tSNPs repli-cating previous findings (rs1370128 and rs1624395), we ob-served that the effects were largest for 22 years of age atdiagnosis (Fig 1) both for rs1370128 (OR, 1.46; 95% CI, 1.14-1.87; P 5 .001; permuted P 5 .021) and rs1624395 (OR, 1.40;95% CI, 1.09-1.79; P 5 .007; permuted P 5 .043). Thereafter,considering only those atopic asthma cases diagnosed at 22 yearsof age or less, we observed nominal associations for 8 tSNPs, allshowing larger effects than when considering all atopic asthmacases (see Table E4). After adjusting for population stratification,all these associations remained significant: rs2701653 (OR, 1.51;95% CI, 1.04-2.19; P 5 .030), rs78503618 (OR, 1.57; 95% CI,1.15-2.16; P 5 .005), rs1732877 (OR, 1.43; 95% CI, 1.11-1.85; P 5 .007), rs1624395 (OR, 1.37; 95% CI, 1.07-1.76; P 5.013), rs1370128 (OR, 1.44; 95% CI, 1.12-1.84; P 5 .004),rs1152912 (OR, 1.36; 95% CI, 1.06-1.76; P 5 .018),rs1152913 (OR, 1.48; 95% CI, 1.14-1.91; P 5 .003), andrs1152916 (OR, 1.44; 95% CI, 1.11-1.86; P5 .007). On the con-trary, none of the tSNPs was significantly associated with atopicasthma diagnosed at age greater than 22 years (.228 <_ P value <_.971, not shown), suggesting that associations found with atopicasthma were likely to be due to the cases with an age at diagnosisof 22 years or less.Testing of untyped variants revealed 8 additional SNPs nom-
inally associated with atopic asthma diagnosed at age 22 years orless (.001 <_ P value <_ .040, Fig 2 and see Table E4). All 16 SNPsnominally associated with atopic asthma diagnosed at age 22years or less were considered significant (FDR <_ 2%), and mostof them were in moderate-to-strong LD. The exception werers2701653 and rs78503618 from the 59 region, which showed
FIG 2. Association P values (in log scale) of IRAK3 gene SNPs with atopic asthma diagnosed at age 22 years
or less and in a meta-analysis across Europeans. An LD plot of r2 values based on resequencing data is
shown for the 58 SNPs of IRAK3, as well as their relative position in the gene. Each diamond of the LD
plot represents the pairwise r2 correlation between SNPs.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRUARY 2012
574 LETTERS TO THE EDITOR
weak LD in pairwise comparisons between them (r25 0.001) andwith the rest of the SNPs of the gene (0.001 <_ r2 <_ 0.319).However, only the inclusion of the SNP rs2701653 as a covariatein logistic regression left a significant association for the 2 SNPsthat replicated previous findings (P 5 .012 and P 5 .007 forrs1624395 and rs1370128, respectively), indicating the presenceof independent associations.Haplotype testing of a previously associated 3-SNP region
(rs11465955, rs1624395 and rs1370128)1 replicated the associa-tion of the protective CGC haplotype (.001 <_P <_.032, see Table E5in this article’s Online Repository at www.jacionline.org).However, the association of the TAT risk haplotype1 was not repli-cated (P >_ .068), although it showed a significant effect in logisticregression (OR, 1.39; 95%CI, 1.07-1.81; P5 .013). Nevertheless,the CAT haplotype was detected as a risk haplotype for all asthmaphenotypes (P <_ .023, 1.37 <_ OR <_ .1.75; see Table E5). A furtherexploration suggested that the 3 SNPs included in haplotypes hadalmost perfect LD (D9) with 2 other nearby SNPs (rs2289134 andrs1732877), revealing similar effects when extending the haplo-types to intron 2 of the IRAK3 gene (see Table E5).
Because our results suggested that atopic asthma cases diag-nosed at age 22 years or less accounted for the discoveredassociations, we explored whether these associations had direc-tionally consistent effects with previous findings by performing ameta-analysis with data from candidate-gene case-control asso-ciation studies of unrelated patients with childhood and early-onset asthma (see the Methods section in this article’s OnlineRepository for further details).1,5 This analysis included 3384samples (736 cases and 2648 control subjects) and compared 7,3, and 5 SNPs overlapping between our samples and Sardinian,Italian, and Japanese subjects, respectively. This joint analysisonly evidenced allele and effect-wise replication among Euro-peans (Fig 2 and see Table E6 in this article’s Online Repositoryat www.jacionline.org), with 1 SNP associated with suggestivesignificance at a genome-wide level (rs1370128; OR, 1.54; 95%CI, 1.31-1.82; P 5 2.9 3 1027). Congruent with these results, astudy of 39 candidate genes in non-Hispanic white nuclear fami-lies with asthma6 reported a nominal association for 2 IRAK3SNPs: rs1821777, which shows an r2 value of 1 with rs2289134associated into haplotypes of 5 SNPs in our study, and
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME 129, NUMBER 2
LETTERS TO THE EDITOR 575
rs1152912, which is also associated in our study. However, alarge-scale asthma GWAS among Europeans reported a P valueof .07 for 1 IRAK3 SNP not tested in this study (rs17826057) ina meta-analysis combining cases with childhood-onset, later-on-set, severe, and occupational asthma, showing nonsignificant re-sults also when the analysis was restricted to asthma cases withonset at less than 16 years.7 Similarly, IRAK3 was not associatedwith childhood asthma among Japanese or Mexican nuclear fam-ilies in which most cases were atopic (90%).5,8 Although morestudies need to be accomplished, the nontransferability of theIRAK3 association with asthma between studies could be due todifferences in LD between populations, genetic and environmen-tal interactions, genetic heterogeneity, or the inadequate genecoverage of previous studies (see Table E7 in this article’s OnlineRepository at www.jacionline.org for gene coverage in Europeansin commercial arrays).8 Thus, despite the fact that SNPs from theIRAK3 gene are not among the GWAS hits for asthma to date,2 ourresults support the importance of this gene in patients with atopicasthma.In this study we performed the first independent replication of
IRAK3 association with asthma,1 examining extensively the mostcommon variation of the gene. Our results replicated the associa-tion of IRAK3 at the SNP and haplotype levels and evidenced thatother variants of the gene had independent effects in atopicasthma. These results were robust to population stratificationand to the differences in age and sex between cases and controlsubjects (not shown). Strikingly, the association of haplotypeswas not restricted to atopic asthma diagnosed at age 22 years orless but also was found among all asthma cases. However, theTAT risk haplotype was not replicated, which could be motivatedby our limited power to detect association on the basis of previousfindings1 (<60% for risks >_1.2 at a 2-sided P value of .05 and avariant frequency of 0.35 to 0.40) or the potential presence of pri-vate risk variants in Sardinians. Moreover, we could not distin-guish the causal variant because all but a few associated SNPswere in moderate-to-strong LD. Despite the fact that the testedtrait was not exactly the same as that analyzed among Italian sam-ples,1 because the persistency of asthma symptoms was not re-corded among GOA samples, the fact that we replicated thesame SNPs and the protective haplotype supports that these re-sults are unlikely to be spurious.In conclusion, our results confirm the importance of the IRAK3
gene in asthma pathogenesis in European populations, supportingthe hypothesis of shared risk factors among complex diseases3
and bolstering the relevance of the hygiene hypothesis in asthmadevelopment.9 Further research is needed to discern whether thisassociation is due to rare gene variants,10 to the biological func-tion of IRAK3, or to LDwith nearby genes, as well as its relevancein non-European populations.
We thank Carole Ober, Deborah Meyers, and the 4 reviewers who helped
improve the article and Tob�ıas Felipe for Fortran scripting.
Mar�ıa Pino-Yanes, MSca,b
Inmaculada S�anchez-Mach�ın, MDc
Jos�e Cumplido, MDd
Javier Figueroa, MDe
Mar�ıa Jos�e Torres-Galv�an, PhDf
Ruperto Gonz�alez, MDc
Almudena Corrales, CLTa,b
Orlando Acosta-Fern�andez, MDg
Jos�e Carlos Garc�ıa-Robaina, MDc
Teresa Carrillo, MDd
Anselmo S�anchez-Palacios, MDe
Jes�us Villar, MD, PhDa,h,i
Mariano Hern�andez, PhDj
Carlos Flores, PhDa,b
From aCIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid,
Spain; bthe Research Unit, Hospital Universitario NS de Candelaria, Tenerife, Spain;cthe Allergy Unit, Hospital Universitario NS de Candelaria, Tenerife, Spain; dthe Al-
lergy Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain;ethe Allergy Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria, Spain; fthe Re-
search Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain;gthe Neumology Unit, Hospital Universitario de Canarias, Tenerife, Spain; hthe Mul-
tidisciplinary Organ Dysfunction Evaluation Research Network (MODERN), Re-
search Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain;ithe Keenan Research Center, St Michael’s Hospital, Toronto, Ontario, Canada; andjthe Genetics Laboratory, Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud
P�ublica de Canarias, Universidad de La Laguna, Tenerife, Spain. E-mail: cflores@ull.
es.
Supported by grants from the Ministry of Science and Innovation of Spain (PI081383)
and FUNCIS (27/07) and by a specific agreement between Instituto de Salud Carlos
III and Gobierno de Canarias (EMER07/001) under the ENCYT 2015 framework.
Disclosure of potential conflict of interest: The authors declare that they have no relevant
conflicts of interest.
REFERENCES
1. Balaci L, Spada MC, Olla N, Sole G, Loddo L, Anedda F, et al. IRAK-M is in-
volved in the pathogenesis of early-onset persistent asthma. Am J Hum Genet
2007;80:1103-14.
2. Ober C, Yao TC. The genetics of asthma and allergic disease: a 21st century per-
spective. Immunol Rev 2011;242:10-30.
3. Pino-Yanes M, Ma SF, Sun X, Tejera P, Corrales A, Blanco J, et al. Interleukin-
1 receptor-associated kinase 3 gene associates with susceptibility to acute lung in-
jury. Am J Respir Cell Mol Biol 2011;45:740-5.
4. Pino-Yanes M, Corrales A, Basald�ua S, Hern�andez A, Guerra L, Villar J, et al.
North African influences and potential bias in case-control association studies in
the Spanish population. PLoS One 2011;6:e18389.
5. Nakashima K, Hirota T, Obara K, Shimizu M, Jodo A, Kameda M, et al. An asso-
ciation study of asthma and related phenotypes with polymorphisms in negative
regulator molecules of the TLR signaling pathway. J Hum Genet 2006;51:284-91.
6. Rogers AJ, Raby BA, Lasky-Su JA, Murphy A, Lazarus R, Klanderman BJ, et al.
Assessing the reproducibility of asthma candidate gene associations, using
genome-wide data. Am J Respir Crit Care Med 2009;179:1084-90.
7. Moffatt MF, Gut IG, Demenais F, Strachan DP, Bouzigon E, Heath S, et al. A
large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. N Engl
J Med 2010;363:1211-21.
8. Wu H, Romieu I, Shi M, Hancock DB, Li H, Sienra-Monge JJ, et al. Evaluation of
candidate genes in a genome-wide association study of childhood asthma in Mex-
icans. J Allergy Clin Immunol 2010;125:321-7, e13.
9. Strachan DP. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ 1989;299:1259-60.
10. Dickson SP, Wang K, Krantz I, Hakonarson H, Goldstein DB. Rare variants create
synthetic genome-wide associations. PLoS Biol 2010;8:e1000294.
Available online November 8, 2011.doi:10.1016/j.jaci.2011.10.001
The C11orf30-LRRC32 region is associatedwith total serum IgE levels in asthmaticpatients
To the Editor:Asthma is a chronic inflammatory respiratory disease charac-
terized by bronchial hyperresponsiveness, increased TH2 cyto-kine levels, and increased serum IgE levels. Atopic dermatitisor eczema is a chronic inflammatory skin disease characterizedby epidermal barrier dysfunction and IgE-mediated sensitization.The only published genome-wide association study (GWAS) ofatopic dermatitis identified rs7927894 on chromosome 11q13.5
METHODS
Ethics statementThis study was approved by the ethics committees at participating
hospitals, and written informed consent was obtained from all subjects.
Study subjectsThis study was conducted by using a case-control design of DNA samples
from unrelated subjects reporting at least 2 generations of Spanish descent.
Case samples that fulfilled the Global Initiative for Asthma guidelines for the
diagnosis and classification of asthma (www.ginasthma.com) were collected
from respiratory medicine and allergy departments as part of the GOA study
in the Spanish population. This sample included 607 patients with physician-
diagnosed asthmawith active specific medication for asthmatic symptoms and
age of 5 years or older. We recorded basic demographic data (age, sex, and
smoking habits), age at diagnosis of the disease, severity of the illness, family
history of allergic disease, allergic symptoms (rhinitis, atopic dermatitis, and
food and drug allergy), basal FEV1, and symptomatic treatment. Atopy was
confirmed by a positive skin prick test response (a wheal with a diameter 3
mm greater than that elicited by the saline control) to one of 7 common aller-
gens, including dust mite, epithelium, pollen, fungi, food, latex, and others, or
by specific serum IgE levels of greater than 0.35 IU/mL. Allergens evaluated
for specific IgE levels were dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus,Der-
matophagoides farinae, Glycyphagus species, Blomia tropicalis, Acarus siro,
Tyrophagus putrescentiae, Lepidoglyphus destructor, and Euroglyphus may-
nei), epithelium (Felis domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Or-
yctolagus cuniculus), pollen (Olea europaea, Salsola species, Lolium perenne,
Artemisia vulgaris, Parietaria species, Platanus species, Chenopodium spe-
cies, Plantago species,Rumex species, andCupressus species), fungi (Penicil-
lium notatum, Alternaria alternate, Aspergillus fumigatus, and Cladosporium
herbarum), food (cow’s milk, hen’s egg, peanut, soybean, wheat, fish, shrimp,
crabs, lobster, clams, oysters, mussels, banana, chestnut, and kiwi), latex, and
cockroache (Blattella germanica).
A total of 1271 DNA samples from subjects self-reporting at least 2
generations of ancestors born in Spain and without personal or familial history
of allergic or pulmonary diseases were used as control samples. These were
obtained from the Spanish National DNA Biobank (www.bancoadn.org), a
member of the Public Population Project in Genomics Consortium (www.
p3gobservatory.org). Briefly, samples were collected from branches of the Na-
tional Blood Service from unrelated subjects residing in Spain. After signing
an informed consent form, donors self-declared general health status, physical
activity, transportation and nutrition habits, employment and qualification, de-
mographics, tobacco smoke, alcohol consumption, genealogical information,
residence andmother tongue, and personal and familiar history of diseases, in-
cluding infectious, cancerous, blood and circulatory, endocrine, mental and
behavioral, respiratory (including asthma symptoms), immunologic (includ-
ing allergies), bone, congenital, skin and digestive, as well as eye and hearing,
disorders. No information from medical records was incorporated or revised,
and no medical testing was performed on donors.
Selection of tSNPstSNPs were selected by using TagIT 3.03E1 with published resequencing
data from 22.6 kb in 32 unrelated healthy Spanish subjects and forcing the in-
clusion of previously associated SNPsE2,E3 and all potential functional vari-
ants, as predicted by PupaSuiteE4 or previously established by us.E3 A final
set of 15 tSNPs was selected (Table E2) and tested for performance by using
an SNP-dropping-with-resampling method,E1 satisfying a haplotype r2 value
of 1.0 in the resequencing data.
Genotyping of tSNPsDNAwas extracted from blood (GFX kit; GE Healthcare, Little Chalfont,
United Kingdom) or saliva (Oragene DNA; DNA Genotek, Inc, Kanata,
Ontario, Canada) and used for whole-genome amplification with the Illustra
GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare). Dilutions of this
product were quantified by using an SYBRGreen I–based DNA quantification
method (Molecular Probes, Eugene, Ore) and genotyped in 2 reactions
containing 7 and 8 tSNPs by means of the SNaPshot Multiplex kit (Applied
Biosystems, Foster City, Calif), as described elsewhere.E3 Electrophoresis was
performed on an ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and gen-
otypes were automatically assigned by using GeneMapper v3.2 (Applied Bi-
osystems). Genotyping was blind to disease status. Approximately 6% of the
samples were genotyped in duplicate to monitor genotyping quality, yielding
an estimated overall discordance rate among duplicated samples of 0.07%
(95% CI, 0.02% to 0.19%). The genotyping completion rate was greater
than 97.7% across all 15 tSNPs (see Table E2).
Assessment of population stratificationNinety-three EuroAIMs were genotyped in case and control samples to
reduce the risk for false-positive results, allowing correcting for major popu-
lation stratification effects among European and Spanish populations.E5,E6
Genotyping of EuroAIMs was conducted by using the iPLEX Gold assay on
the MassARRAY system, and genotype calls were automatically generated
by using all data from the study simultaneously with TYPER 3.4 software
(Sequenom, San Diego, Calif) by the Spanish National Genotyping Center,
Santiago de Compostela Node (CeGen, www.cegen.org). Of 93 EuroAIMs,
83 markers were successfully genotyped and considered for the final analysis
(see Table E3). Our previous studies have demonstrated that a subset of as few
as 65 of theseEuroAIMs effectively controlled false-positive results in Spanish
case-control association studies.E6 On the basis of these markers, principal
component analysis was used to derive the scores for the PC1 as ancestry esti-
mates in cases and control subjects. This analysis was performedwith EIGEN-
SOFT,E7 as described elsewhere.E6
Statistical analysisClinical and demographic data were analyzed by using x2 and Mann-
WhitneyU tests with SPSS 15.0 software (SPSS, Inc, Chicago, Ill). Departures
from Hardy-Weinberg equilibrium were evaluated separately for cases and
control subjects by using an exact test.E8 Because none of the tSNPs deviated
significantly from Hardy-Weinberg equilibrium in the control group (thresh-
old for significance after considering the multiple comparisons performed
was a P value of .003), all tSNPs were retained for the association analyses.
Further details can be found in Table E2.
Individual tSNP associations were tested by using the Cochran-Armitage
trend test, assuming an additive model, and the empiric P value was obtained
by using 1000 permutations with a custom script for STATISTICA (StatSoft,
Inc, Tulsa, Okla).E9 Logistic regression analysis was used to calculate allelic
effects as ORswith 95%CIs, to adjust for population stratification by using the
PC1 scores as a covariate, and to test the independence of associations be-
tween SNPs. These analyses were performed with SPSS 15.0 software
(SPSS, Inc).
Because a previous study evidenced an increase of allelic effects among
cases with onset at less than 13 years, we explored whether the allelic effects
varied with the age at diagnosis to estimate the trait cutoff at which the allelic
effects were largest. For that, a previously described algorithm was used.E10
Briefly, individual SNP associations were computed as above but repeatedly
for each group of cases resulting from the sequential incorporation of atopic
asthmatic patients for every increase in 1 year in the age of diagnosis (starting
from the age of 11 years, for which the study accumulated>50 cases). The em-
piric P value, adjusted for the multiple tests done, was then obtained from the
comparison of the smallest nominal P value from all tests done with P values
calculated from permuting genotypes 1000 times among thewhole sample (by
reshuffling labels of cases and controls) as the proportion of permutation rep-
licates that yielded P values smaller than that observed in the actual dataset.
Untyped SNPswithmultilocus LD values of .7 or greaterE11 or with aminor
allele frequency (MAF) of 10%or greater were imputed from tSNPs and tested
for association by means of TUNA version 1.1E11 to limit the imputation er-
ror,E3 allowing us to analyze 15 additional SNPs of the gene. Haplotypes
from the resequencing data were estimated with PHASE 2.1E12 to be used
as a reference for the underlying LD across the gene. An FDR was assessed
with QVALUEE13 considering all 30 SNPs tested (15 tSNPs and 15 imputed
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRUARY 2012
575.e1 LETTERS TO THE EDITOR
SNPs) to judge the SNP associations in the context of the multiple compari-
sons performed. An omnibus test overall haplotype frequency distribution
was first obtained with WHAP to determine whether there were haplotype as-
sociations.E14 Then the statistical significance for the association of specific
haplotypes was assessed by using logistic regression with HAPSTAT,E15
and ORs and 95%CIs were obtained by using THESIAS,E16 with the latter us-
ing the most common haplotype as a reference.
Under the principle that if SNPs had consistent effects (ie, allele and effect
wise) among different studies, a joint analysis would improve the results
obtained from the studies by using a separate analysis, a meta-analysis of
association for the SNPs overlapping across our study and the previous
onesE2,E17 was performed. For this purpose, fixed and random effects meta-
analyses were examined with the R library rmeta version 2.16.E18 The patterns
of LD, as r2 and D9 values, were explored with Haploview 3.32.E19
Finally, an evaluation of the array coverage of SNPs from the IRAK3 gene
with MAFs of 5% or greater in the GWAS performed in samples of European
ancestry to date was assessed.E20-E26 For that, the information of SNPs con-
tained in the arrays was downloaded from the UCSC Genome Bioinformatics
Web page (http://genome.ucsc.edu) for the region delimited by our resequenc-
ing survey. Gene coverage was then assessed as the proportion of SNPs that
were captured by the array both directly and indirectly (with a multimarker
r2 >_ 0.8) with respect to the total number of SNPs with MAFs of 5% or greater
in Utah residents with ancestry from northern and western Europe from Hap-
Map release 28 and in our resequencing data.
REFERENCES
E1. Ahmadi KR, Weale ME, Xue ZY, Soranzo N, Yarnall DP, Briley JD, et al. A
single-nucleotide polymorphism tagging set for human drug metabolism and trans-
port. Nat Genet 2005;37:84-9.
E2. Balaci L, Spada MC, Olla N, Sole G, Loddo L, Anedda F, et al. IRAK-M is in-
volved in the pathogenesis of early-onset persistent asthma. Am J Hum Genet
2007;80:1103-14.
E3. Pino-Yanes M, Ma SF, Sun X, Tejera P, Corrales A, Blanco J, et al. Interleukin-
1 receptor-associated kinase 3 gene associates with susceptibility to acute lung in-
jury. Am J Respir Cell Mol Biol 2011;45:740-5.
E4. Conde L, Vaquerizas JM, Dopazo H, Arbiza L, Reumers J, Rousseau F, et al.
PupaSuite: finding functional single nucleotide polymorphisms for large-scale gen-
otyping purposes. Nucleic Acids Res 2006;34:W621-5.
E5. Price AL, Butler J, Patterson N, Capelli C, Pascali VL, Scarnicci F, et al. Discern-
ing the ancestry of European Americans in genetic association studies. PLoS Genet
2008;4:e236.
E6. Pino-Yanes M, Corrales A, Basald�ua S, Hern�andez A, Guerra L, Villar J, et al.
North African influences and potential bias in case-control association studies in
the Spanish population. Plos One 2011;6:e18389.
E7. Price AL, Patterson NJ, Plenge RM, Weinblatt ME, Shadick NA, Reich D. Princi-
pal components analysis corrects for stratification in genome-wide association
studies. Nat Genet 2006;38:904-9.
E8. Wigginton JE, Cutler DJ, Abecasis GR. A note on exact tests of Hardy-Weinberg
equilibrium. Am J Hum Genet 2005;76:887-93.
E9. Sun X, Ma SF, Wade MS, Flores C, Pino-Yanes M, Moitra J, et al. Functional var-
iants of sphingosine-1-phosphate receptor 1 gene associate with asthma suscepti-
bility. J Allergy Clin Immunol 2010;126:241-9, e1-3.
E10. Macgregor S, Craddock N, Holmans PA. Use of phenotypic covariates in
association analysis by sequential addition of cases. Eur J Hum Genet 2006;14:
529-34.
E11. Wen X, Nicolae DL. Association studies for untyped markers with TUNA. Bio-
informatics 2008;24:435-7.
E12. Stephens M, Smith NJ, Donnelly P. A new statistical method for haplotype recon-
struction from population data. Am J Hum Genet 2001;68:978-89.
E13. Storey JD, Tibshirani R. Statistical significance for genomewide studies. Proc
Natl Acad Sci U S A 2003;100:9440-5.
E14. Purcell S, Daly MJ, Sham PC. WHAP: haplotype-based association analysis.
Bioinformatics 2007;23:255-6.
E15. Lin DY, Hu Y, Huang BE. Simple and efficient analysis of disease association
with missing genotype data. Am J Hum Genet 2008;82:444-52.
E16. Tregouet DA, Escolano S, Tiret L, Mallet A, Golmard JL. A new algorithm for
haplotype-based association analysis: the Stochastic-EM algorithm. Ann Hum
Genet 2004;68:165-77.
E17. Nakashima K, Hirota T, Obara K, Shimizu M, Jodo A, Kameda M, et al. An
association study of asthma and related phenotypes with polymorphisms in neg-
ative regulator molecules of the TLR signaling pathway. J Hum Genet 2006;51:
284-91.
E18. R Development Core Team. R: a language and environment for statistical com-
puting. Vienna (Austria): R Development Core Team; 2008.
E19. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of
LD and haplotype maps. Bioinformatics 2005;21:263-5.
E20. Moffatt MF, Kabesch M, Liang L, Dixon AL, Strachan D, Heath S, et al. Genetic
variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood
asthma. Nature 2007;448:470-3.
E21. Himes BE, Hunninghake GM, Baurley JW, Rafaels NM, Sleiman P, Strachan DP,
et al. Genome-wide association analysis identifies PDE4D as an asthma-
susceptibility gene. Am J Hum Genet 2009;84:581-93.
E22. Sleiman PM, Flory J, Imielinski M, Bradfield JP, Annaiah K, Willis-Owen SA,
et al. Variants of DENND1B associated with asthma in children. N Engl J Med
2010;362:36-44.
E23. Li X, Howard TD, Zheng SL, Haselkorn T, Peters SP, Meyers DA, et al. Genome-
wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLA-DR/DQ re-
gions. J Allergy Clin Immunol 2010;125:328-35, e11.
E24. Moffatt MF, Gut IG, Demenais F, Strachan DP, Bouzigon E, Heath S, et al. A
large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. N Engl
J Med 2010;363:1211-21.
E25. Ferreira MA, McRae AF, Medland SE, Nyholt DR, Gordon SD, Wright MJ, et al.
Association between ORMDL3, IL1RL1 and a deletion on chromosome 17q21
with asthma risk in Australia. Eur J Hum Genet 2011;19:458-64.
E26. Torgerson DG, Ampleford EJ, Chiu GY, Gauderman WJ, Gignoux CR,
Graves PE, et al. Meta-analysis of genome-wide association studies of
asthma in ethnically diverse North American populations. Nat Genet 2011;
43:887-92.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME 129, NUMBER 2
LETTERS TO THE EDITOR 575.e2
TABLE E1. Relevant demographic and clinical features of samples
Variable Cases (n 5 607) Control subjects (n 5 1271) P value
Sex (% males) 23.3 (567) 59.1 (1270) <.001*
Age (y), mean, P25-P75 37, 25-44 (569) 40, 32-48 (1270) <.001�Smoking habits (% ever smokers) 27.3 (344) 48.1 (1122) <.001*
Clinical features
Serum IgE levels (IU/mL), mean, P25-P75 478.1, 89.3-394.5 (259) NA
Age at diagnosis (y), mean, P25-P75 28, 14-39 (570) NA
FEV1 (% predicted), mean, P25-P75 82, 68-95 (231) NA
Rhinitis (% positive) 74.2 (485) NA
Dermatitis (% positive) 20.2 (480) NA
SPT response (% positive) 76.6 (445) NA
Specific IgE (% positive) 51.2 (287) NA
Atopy (% positive) 76.7 (464) NA
Treatment
Inhaled corticoids (%) 85.6 (250) NA
Oral corticoids (%) 4.6 (305) NA
Long-acting b2-agonists (%) 53.0 (317) NA
Short-acting b2-agonists (%) 81.8 (231) NA
Body mass index (kg m22), mean, P25-P75 24.6, 21.1-27.5 (227) NA
Numbers in parentheses indicate the total number of subjects with available data.
NA, Not available; P25, percentile 25; P75, percentile 75.
*x2 Test.
�Mann-Whitney U test.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRUARY 2012
575.e3 LETTERS TO THE EDITOR
TABLE E2. Information, CRs, and HWE P values for IRAK3 tSNPs
rs No. Position* SNP (effect) CR (%)
HWE P value
Control
subjects
Asthmatic
patients
Atopic asthmatic
patients
Diagnosed
at <_22 y
rs1732887 64867883 21464A>G 98.7 .004 .579 .779 .404
rs2701653 64868152 21195C>T 98.1 .312 .276 .570 .754
rs1732886 64870029 c.1331550A>G 98.1 .014 .912 .888 .579
rs78503618 64871319 c.13311841_1853delGGAAGTGGTCAGT 98.7 .278 .534 .368 .201
rs2289134 64884954 c.31611014T>C 98.3 .307 .654 .909 1.000
rs1732877 64885411 c.31611471T>C 97.7 .642 .616 .157 .515
rs11465955 64889666 c.381199C>T 98.2 .250 .721 .909 .907
rs1152888 64891495 c.439G>A (p.Val147lle) 98.0 .434 .139 .766 .289
rs1624395 64904483 c.65422287G>A 98.9 .593 1.000 .519 .513
rs1370128 64904905 c.65421865C>T 98.5 .522 .457 .164 .589
rs11176095 64919952 c.88824581T>C 98.7 .005 .168 .421 .034
rs1152912 64920175 c.88824358G>A 98.3 .280 .808 .245 .750
rs1152913 64920682 c.88823851T>A 98.2 .865 .060 .031 .139
rs1152916 64921571 c.88822962A>T 98.9 1.000 .056 .152 .072
rs10506481 64930378 *2157T>C 98.3 .114 .011 .218 .003
Nominally significant associations are shown in boldface.
CR, Completion rate; HWE, hardy-Weinberg equilibrium.
*According to National Center for Biotechnology Information build 36.3.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME 129, NUMBER 2
LETTERS TO THE EDITOR 575.e4
TABLE E3. Summary statistics for EuroAIMs successfully genotyped in this study
rs No. Alleles Chromosome Position* CR (%)
MAF HWE P values
Control subjects Asthmatic patients Control subjects Asthmatic patients
rs1157492 C/T 1 211627299 97.9 0.430 0.397 .908 .549
rs11807062 A/C 1 3176394 97.5 0.171 0.179 .070 .089
rs1416467 A/G 1 80470749 98.5 0.491 0.469 .910 .162
rs1890131 C/T 1 164329131 98.3 0.303 0.293 .893 .694
rs2236876 A/G 1 169749143 97.2 0.315 0.325 .427 .347
rs2419063 A/G 1 186988492 97.8 0.105 0.122 1.000 .702
rs495347 C/T 1 17909228 98.6 0.304 0.300 .592 .285
rs725974 G/T 1 167344909 96.7 0.187 0.215 1.000 .275
rs7552548 A/G 1 82775867 96.5 0.320 0.310 .030 .177
rs10496610 C/G 2 123757682 99.2 0.230 0.222 .749 1.000
rs1448314 A/G 2 223811705 98.1 0.087 0.089 .101 .307
rs1517407 A/G 2 63401982 98.2 0.474 0.469 .046 .323
rs3769005 C/G 2 136437098 98.2 0.482 0.523 .255 .805
rs4832640 C/T 2 19025771 97.1 0.255 0.272 .200 .214
rs6432110 A/T 2 10688616 98.1 0.431 0.458 .017 .620
rs6745653 C/T 2 97748515 98.8 0.116 0.124 .679 .709
rs1879558 C/T 3 155137053 98.7 0.188 0.176 .307 .122
rs2596834 C/T 3 10795067 95.4 0.495 0.470 .013 .561
rs4686497 A/G 3 190124209 98.3 0.168 0.205 .042 .209
rs822759 G/T 3 22948116 98.6 0.324 0.356 .846 .214
rs9290675 C/T 3 180489335 99.1 0.131 0.120 .135 .562
rs9861816 C/G 3 195649797 98.2 0.259 0.240 .235 .501
rs10516982 G/T 4 96963279 98.1 0.272 0.289 .566 .135
rs1373557 G/T 4 167601812 98.9 0.202 0.199 .332 .201
rs17443616 A/G 4 41063093 98.5 0.306 0.311 .640 .182
rs1873195 C/T 4 38713739 98.5 0.301 0.267 .788 .021
rs2014303 A/C 4 10262125 97.8 0.221 0.224 .869 .289
rs2251432 A/G 4 191063741 97.7 0.208 0.190 .195 .503
rs4555709 C/T 4 53867889 99.2 0.073 0.074 .035 .559
rs9328764 A/G 4 2143685 98.6 0.160 0.174 .599 .398
rs974020 C/T 4 117865302 98.6 0.296 0.270 .153 .470
rs16891982 C/G 5 33987450 99.3 0.201 0.253 .429 .452
rs33706 C/G 5 87540920 98.6 0.284 0.305 .036 .290
rs3822616 A/G 5 94828145 98.4 0.192 0.183 .143 .338
rs10484547 C/G 6 29560753 99.4 0.071 0.083 .828 .592
rs2187684 C/T 6 32872697 98.0 0.360 0.341 .902 .273
rs2804756 C/T 6 698586 99.1 0.086 0.079 .151 .253
rs756147 A/G 6 141672412 99.5 0.055 0.077 .009 .773
rs10486207 A/G 7 7884020 98.4 0.282 0.273 .184 .917
rs17864053 A/G 7 89801957 98.6 0.209 0.210 .229 .806
rs1922086 C/T 7 155515702 97.7 0.394 0.414 .006 .312
rs2097884 A/C 7 4125658 97.4 0.251 0.257 .172 .747
rs2219248 C/T 7 113965977 98.7 0.355 0.350 1.000 .059
rs2367191 A/G 7 141571268 98.3 0.413 0.405 .412 .671
rs2905347 A/G 7 22393559 96.4 0.435 0.449 .640 .677
rs10504924 C/T 8 94157437 97.7 0.092 0.123 .864 .704
rs920590 C/T 8 19695441 98.2 0.372 0.366 .114 .479
rs10512122 C/G 9 81715524 98.6 0.175 0.165 .170 .458
rs1408794 A/G 9 12641340 94.8 0.477 0.523 .011 .004
rs2086085 A/C 9 1680761 99.1 0.106 0.120 .455 .019
rs1045873 A/C 10 25177778 98.6 0.301 0.281 .105 .268
rs10508372 A/G 10 9012024 99.6 0.087 0.092 .723 .216
rs10509384 A/G 10 78693188 97.3 0.298 0.284 .276 .611
rs10509954 A/G 10 113658378 98.4 0.109 0.115 .143 .105
rs379773 C/G 10 109905342 95.4 0.353 0.354 .704 .470
rs7908825 C/G 10 75224547 97.4 0.324 0.312 1.000 .104
rs1560569 A/G 11 8896463 97.2 0.344 0.340 .344 .781
rs2847502 C/T 11 119623708 98.9 0.306 0.304 .206 .847
rs4938377 G/T 11 116801502 98.1 0.063 0.076 1.000 .141
rs923031 A/C 11 15777602 98.3 0.468 0.449 .138 .741
rs1003306 A/T 12 2624458 98.0 0.339 0.372 .447 .005
(Continued)
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
FEBRUARY 2012
575.e5 LETTERS TO THE EDITOR
TABLE E3. (Continued)
rs No. Alleles Chromosome Position* CR (%)
MAF HWE P values
Control subjects Asthmatic patients Control subjects Asthmatic patients
rs1582398 A/G 12 78624019 97.5 0.129 0.140 .377 .732
rs3809125 C/T 12 55130616 98.3 0.367 0.369 .112 .724
rs7965049 A/G 12 7537044 97.5 0.245 0.253 .357 .227
rs998401 A/G 12 53641500 98.0 0.074 0.074 .058 1.000
rs7997100 C/T 13 67988075 98.4 0.349 0.348 .010 .719
rs986642 C/G 13 56944263 98.8 0.239 0.268 .160 .009
rs10483853 A/G 14 72826052 98.7 0.234 0.257 .344 .236
rs10519269 A/C 15 77705433 96.5 0.106 0.130 .095 .586
rs1129038 C/T 15 26030454 98.4 0.331 0.341 .898 .927
rs7163907 C/T 15 73632152 98.9 0.303 0.328 .254 .164
rs1107820 C/T 17 41491195 97.4 0.274 0.242 1.000 .120
rs1476162 A/G 17 8031808 98.6 0.135 0.146 .544 1.000
rs2003092 A/G 17 59516509 97.7 0.274 0.314 1.000 .337
rs959260 C/T 17 70881017 98.3 0.218 0.215 .934 .716
rs2418844 A/G 18 26037261 97.8 0.489 0.503 .253 .806
rs4892082 A/C 18 69051672 97.5 0.123 0.131 1.000 .721
rs523776 C/T 18 7554299 98.4 0.242 0.220 1.000 .722
rs959763 G/T 18 56797826 98.0 0.363 0.386 .854 .796
rs103294 C/T 19 59489660 98.7 0.162 0.156 .835 .643
rs202546 C/T 20 1611539 97.3 0.429 0.438 .449 .675
rs477627 A/G 20 47613465 97.6 0.193 0.217 .647 .904
rs969539 A/G 22 24942341 97.2 0.374 0.362 .626 .211
CR, Completion rate; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium.
*According to National Center for Biotechnology Information build 35.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME 129, NUMBER 2
LETTERS TO THE EDITOR 575.e6
TABLE E4. Association summary, including unadjusted effects and P values, of IRAK3 SNPs with asthma and atopic asthma
rs No. Position* SNPy (effect)
Risk
allele
Minor allele frequency OR (95% CI)z P value§
Control
subjects
Asthmatic
patients
Atopic
asthmatic
patients
Diagnosed
at <_22 y
Asthmatic
patients
Atopic
asthmatic
patients
Diagnosed
at <_22 y
Asthmatic
patients
Atopic
asthmatic
patients
Diagnosed
at <_22 y
rs1732888 64867853 21494T>C T 0.273 0.258 0.269 0.228 .344 .819 .098
rs1732887 64867883 21464A>G A 0.258 0.243 0.254 0.210 1.09 (0.93-1.27) 1.02 (0.85-1.23) 1.28 (0.96- 1.72) .309 .819 .082
rs2701653 64868152 21195C>T T 0.094 0.104 0.106 0.134 1.14 (0.91-1.42) 1.15 (0.88-1.51) 1.49 (1.03-2.14) .307 .355 .034
rs1732886 64870029 c.1331550A>G A 0.256 0.242 0.247 0.205 1.08 (0.92-1.25) 1.04 (0.87-1.27) 1.32 (0.98-1.75) .368 .610 .061
rs78503618 64871319 c.13311841_
1853delG
GAAGTGG
TCAGT
ins 0.267 0.269 0.231 0.192 .99 (0.85-1.16) 1.22 (1.00-1.49) 1.54 (1.12-2.13) .866 .057 .004
rs56156535 64872409 c.13312931T>C C 0.402 0.422 0.439 0.463 .181 .046 .040
rs1168774 64877754 c.13426004A>G G 0.429 0.458 0.472 0.483 .038 .014 .001
rs4762088 64877849 c.13425909G>C C 0.386 0.407 0.425 0.449 .167 .048 .039
rs17767286 64878509 c.13425249C>A A 0.379 0.394 0.411 0.433 .325 .111 .071
rs17767298 64879508 c.13424250A>G G 0.362 0.377 0.393 0.413 .316 .108 .072
rs1882200 64883968 c.316128C>T T 0.331 0.347 0.365 0.384 .343 .084 .105
rs2289134 64884954 c.31611014T>C C 0.334 0.347 0.365 0.385 1.06 (0.91-1.22) 1.14 (0.96-1.36) 1.24 (0.96-1.59) .410 .117 .095
rs1732877 64885411 c.31611471T>C C 0.417 0.445 0.470 0.488 1.13 (0.98-1.29) 1.24 (1.04-1.46) 1.46 (1.13-1.89) .113 .008 .003
rs11465955 64889666 c.381199C>T T 0.334 0.350 0.368 0.392 1.07 (0.93-1.24) 1.16 (0.97-1.37) 1.28 (0.99-1.64) .293 .082 .058
rs2293657 64891273 c.4372220A>T T 0.286 0.310 0.327 0.348 .067 .018 .010
rs1152888 64891495 c.439G>A (p.Val147lle) A 0.080 0.091 0.100 0.112 1.17 (0.92-1.49) 1.29 (0.97-1.72) 1.46 (0.98-2.17) .270 .085 .070
rs1821777 64892495 c.5881851C>T T 0.343 0.350 0.369 0.390 .677 .177 .088
rs55715236 64904334 c.65422436C>T T 0.329 0.338 0.359 0.383 .589 .158 .068
rs1623665 64904449 c.65422321G>T T 0.415 0.442 0.466 0.489 .124 .023 .005
rs1624395 64904483 c.65422287G>A A 0.392 0.419 0.442 0.475 1.12 (0.98-1.29) 1.23 (1.04-1.45) 1.40 (1.09-1.79) .101 .013 .007
rs1370127 64904584 c.65422186G>A A 0.392 0.419 0.442 0.475 .106 .022 .012
rs1370128 64904905 c.65421865C>T T 0.415 0.443 0.466 0.489 1.12 (0.98-1.29) 1.22 (1.04-1.44) 1.46 (1.14-1.87) .107 .011 .001
rs10716217 64908730 c.8871313delA delA 0.415 0.442 0.466 0.489 .125 .017 .001
rs1152908 64915771 c.88717354T>A A 0.399 0.423 0.444 0.484 .126 .015 .005
rs11176095 64919952 c.88824581T>C C 0.062 0.066 0.074 0.088 1.10 (0.84-1.44) 1.24 (0.90-1.70) 1.48 (0.96-2.28) .618 .235 .086
rs1152912 64920175 c.88824358G>A A 0.479 0.483 0.499 0.561 1.02 (0.88-1.17) 1.10 (0.93-1.30) 1.40 (1.09-1.81) .856 .273 .006
rs1152913 64920682 c.88823851T>A A 0.496 0.492 0.463 0.401 1.05 (0.92-1.20) 1.18 (1.00-1.39) 1.51 (1.17-1.94) .515 .057 .003
rs1152915 64920925 c.88823608A>C C 0.304 0.312 0.318 0.304 .605 .428 .986
rs1152916 64921571 c.88822962A>T A 0.443 0.425 0.402 0.353 1.08 (0.94-1.23) 1.18 (1.00-1.40) 1.46 (1.13-1.89) .310 .043 .002
rs10506481 64930378 *2157T>C T 0.123 0.120 0.124 0.104 1.03 (0.84-1.27) 1.00 (0.78-1.28) 1.20 (0.81-1.79) .767 .986 .362
tSNPs are underlined. Nominally significant associations are shown in boldface.
*According to National Center for Biotechnology Information (NCBI) build 36.3.
�According to the sequence with NCBI accession no. NC_000012.10.
�Calculated only for the genotyped SNPs.
§Obtained from 1000 permutations.
JALLERGYCLIN
IMMUNOL
FEBRUARY2012
575.e7
LETTERSTO
THEEDITOR
TABLE E5. Analysis of haplotypes of 3 or 5 SNPs
Frequencies P value OR (95% CI); P valuey
Haplotype*
Control
subjects
Asthmatic
patients
Atopic
asthmatic
patients
Diagnosed
at <_22 y
Asthmatic
patients
Atopic
asthmatic
patients
Diagnosed
at <_22 y Asthmatic patients
Atopic asthmatic
patients Diagnosed at <_22 y
CGC 0.582 0.545 0.525 0.481 .032 .006 .001 Reference Reference Reference
TAT .329 .340 .361 .383 .494 .113 .068 1.09 (0.94-1.27); .267 1.18 (0.98-1.41); .077 1.39 (1.07-1.81); .013
CAT 0.062 0.082 0.084 0.091 .029 .043 .066 1.37 (1.05-1.80); .020 1.46 (1.05-2.02); .023 1.75 (1.12-2.74); .015
CGT 0.022 0.022 0.027 0.036 .984 .957 .154 1.05 (0.65-1.68); .854 0.96 (0.52-1.80); .909 1.89 (0.94-3.83); .076
Omnibus .071 .035 .010
TTCGC 0.578 0.542 0.522 0.477 .077 .011 .003 Reference Reference Reference
CCTAT 0.327 0.336 0.358 0.376 .417 .118 .093 1.08 (0.93-1.26); .288 1.15 (0.97-1.39); .111 1.35 (1.03-1.77); .031
TCCAT 0.060 0.082 0.085 0.093 .016 .019 .035 1.37 (1.05-1.80); .022 1.43 (1.03-1.98); .032 2.01 (1.27-3.19); .003
TCCGT 0.021 0.021 0.022 0.035 .973 .941 .199 1.04 (0.64-1.70); .877 1.02 (0.55-1.88); .958 1.36 (0.62-3.00); .439
Omnibus .084 .035 .019
Nominally significant associations are shown in boldface. SNPs included in the haplotypes studied by Balaci et alE2 are underlined.
*Haplotypes are defined by 3 tSNPs (rs11465955, rs1624395, and rs1370128) or 5 SNPs SNPs (rs2289134, rs1732877, rs11465955, rs1624395, and rs1370128).
�P value from regression logistic model by using the most common haplotype as reference.
JALLERGYCLIN
IMMUNOL
VOLUME129,NUMBER2
LETTERSTO
THEEDITOR
575.e8
TABLE E6. Meta-analysis of IRAK3 SNPs in unrelated case-control samples
Rs no.
Risk
allele
Minor allele frequency Association tests
Spanish Sardinian Italian Japanese
Individual studies
OR (95% CI)*; P value
Meta-analysis
OR (95% CI)*; P value
Control
subjects
(n 5 1271)
Casesy(n5 139)
Control
subjects
(n 5 460)
Cases
(n 5 139)
Control
subjects
(n 5 278)
Cases
(n 5 67)
Control
subjects
(n 5 639)
Cases
(n 5 391) Spanishz Sardinian Italian Japanese§ Europeans All samples§
rs1732887 A 0.26 0.21 0.10 0.09 1.28 (0.96-1.72); .082 1.06 (0.78-1.43); .725 1.18 (0.95-1.46);
.1420
rs2701653 T 0.09 0.13 0.41 0.43 1.49 (1.03-2.14); .034 1.05 (0.87-1.25); .620 1.11 (0.95-1.31);
.1791
rs1732886 A 0.26 0.21 0.21 0.16 1.32 (0.98-1.75); .061 1.40 (0.98-2.00); .106 1.36 (1.08-1.72); .0105
rs1882200 T 0.33 0.38 0.34 0.46 1.25 (0.97-1.61); .105 1.65 (1.26-2.17); .001 1.42 (1.18-1.71); .0002
rs11465955 T 0.33 0.39 0.35 0.46 0.34 0.43 1.28 (0.99-1.64); .058 1.56 (1.18-2.04); .001 1.48 (1.01-2.18);
.029
1.42 (1.2-1.68); .0001
rs2293657 T 0.29 0.35 0.34 0.46 0.12 0.15 1.32 (1.01-1.71); .010 1.65 (1.26-2.17); .001 1.07 (0.82-1.39); .180 1.47 (1.22-1.77); .0001 1.31 (1.13-1.53);
.0004
rs1152888 A 0.08 0.11 0.40 0.40 1.46 (0.98-2.17); .07 0.96 (0.81-1.15); .839 1.03 (0.87-1.21);
.3719
rs1821777 T 0.34 0.39 0.36 0.46 1.22 (0.94-1.57); .088 1.54 (1.17-2.02); .001 1.36 (1.13-1.63); .0013
rs1624395 A 0.39 0.48 0.42 0.51 0.40 0.53 1.40 (1.09-1.79); .007 1.46 (1.11-1.91); .002 1.68 (1.15-2.46);
.004
1.47 (1.25-1.74);
5.7 3 1026
rs1370128 T 0.42 0.49 0.43 0.54 0.41 0.55 1.46 (1.14-1.87); .001 1.53 (1.16-2.00); .001 1.76 (1.21-2.58);
.002
1.54 (1.31-1.82);
2.9 3 1027
rs10716217 delA 0.42 0.49 0.54 0.55 1.50 (1.17-1.92); .001 1.04 (0.87-1.24); .685 1.17 (1.02-1.36);
.0295
*From an additive model.
�Atopic asthma diagnosed at 22 years or younger.
�From Table E4.
§Only childhood cases from the Japanese study were considered in this analysis.
JALLERGYCLIN
IMMUNOL
FEBRUARY2012
575.e9
LETTERSTO
THEEDITOR
TABLE E7. Coverage of SNPs from the IRAK3 gene with MAFs of
5% or greater on commercial arrays used in asthma GWASs in
samples of European ancestry*
Coverage (%)
SNP array HapMap CEU Resequencing
Affymetrix 500K 63 29
Affymetrix Genome-Wide Human
SNP Array 6.0
93 71
Illumina HumanHap300� 77 19
Illumina HumanHap550� 83 35
Illumina HumanHap650Y 83 42
Illumina 1M-Duo 97 65
CEU, Ancestry from northern and western Europe.
*Includes studies described in Moffatt et al, 2007E20; Himes et al, 2009E21; Sleiman
et al, 2009E22; Li et al, 2010E23; Moffatt et al, 2010E24; Ferreira et al, 2011E25; and
Torgerson et al, 2011.E26
�Including the Illumina HumanCNV370-Duo as it was built on the Illumina
HumanHap300 BeadChip (317,000 SNPs) with an additional 52,000 markers aimed at
detecting copy number variations.
�Including the Illumina Human610 because it is similar to the Illumina
HumanHap550 with the addition of 60,000 markers to target regions with copy
number variations.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME 129, NUMBER 2
LETTERS TO THE EDITOR 575.e10
BRIEF COMMUNICATION
No association between genetic ancestry and susceptibilityto asthma or atopy in Canary Islanders
María Pino-Yanes & Almudena Corrales &
José Cumplido & Ruperto González &
María José Torres-Galván &
Orlando Acosta Fernández &
Inmaculada Sánchez-Machín & Javier Figueroa &
Anselmo Sánchez-Palacios & Jesús Villar &
Mariano Hernández & Teresa Carrillo & Carlos Flores
Received: 12 April 2012 /Accepted: 6 June 2012 /Published online: 19 June 2012# Springer-Verlag 2012
Abstract Asthma is a complex respiratory disease charac-terized by chronic inflammation of airways and frequentlyassociated with atopic symptoms. The population from theCanary Islands, which has resulted from a recent admixtureof North African and Iberian populations, shows the highestprevalence of asthma and atopic symptoms among the Span-ish populations. Although environmental particularitieswould account for the majority of such disparity, geneticancestry might play a role in increasing the susceptibility of
asthma or atopy, as have been demonstrated in other recent-ly African-admixed populations. Here, we aimed to explorewhether genetic ancestry was associated with asthma orrelated traits in the Canary Islanders. For that, a total of734 DNA samples from unrelated individuals of the GOAstudy, self-reporting at least two generations of ancestorsfrom the Canary Islands (391 asthmatics and 343 controls),were successfully genotyped for 83 ancestry informativemarkers (AIMs), which allowed to precisely distinguishing
Electronic supplementary material The online version of this article(doi:10.1007/s00251-012-0631-3) contains supplementary material,which is available to authorized users.
M. Pino-Yanes :A. Corrales : J. Villar : C. FloresCIBER de Enfermedades Respiratorias,Instituto de Salud Carlos III,Madrid, Spain
M. Pino-Yanes :A. Corrales : C. Flores (*)Research Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria,Carretera del Rosario s/n,38010 Santa Cruz, Tenerife, Spaine-mail: cflores@ull.edu.es
J. Cumplido : T. CarrilloAllergy Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin,Las Palmas de Gran Canaria, Spain
R. González : I. Sánchez-MachínAllergy Unit, Hospital del Tórax,Complejo Hospitalario Universitario NS Candelaria,Tenerife, Spain
M. J. Torres-GalvánResearch Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin,Las Palmas de Gran Canaria, Spain
O. A. FernándezNeumology Unit, Hospital Universitario de Canarias,Tenerife, Spain
J. Figueroa :A. Sánchez-PalaciosAllergy Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria,Las Palmas de Gran Canaria, Spain
J. VillarMultidisciplinary Organ Dysfunction Evaluation ResearchNetwork (MODERN), Research Unit,Hospital Universitario Dr. Negrin,Las Palmas de Gran Canaria, Spain
J. VillarKeenan Research Center, St. Michael’s Hospital,Toronto, ON, Canada
M. HernándezGenetics Laboratory, Instituto Universitario de EnfermedadesTropicales y Salud Pública de Canarias,Universidad de La Laguna,Tenerife, Spain
Immunogenetics (2012) 64:705–711DOI 10.1007/s00251-012-0631-3
Author's personal copy
between North African and Iberian ancestries. No associa-tion was found between genetic ancestry and asthma orrelated traits after adjusting by demographic variables dif-fering among compared groups. Similarly, none of the indi-vidual AIMs was associated with asthma when results wereconsidered in the context of the multiple comparisons per-formed (0.005≤p value≤0.042; 0.221≤q value≤0.443). Ourresults suggest that if genetic ancestry were involved in thesusceptibility to asthma or related traits among CanaryIslanders, its effects would be modest. Larger studies, ex-amining more genetic variants, would be needed to exploresuch possibility.
Keywords Allergy . Genetic susceptibility . North Africa .
Admixture
Asthma is a complex respiratory disease characterized bychronic inflammation of airways and frequently associatedwith atopic symptoms (Ober 2005). Although environmen-tal factors are involved in its pathogenesis, familiar cluster-ing, twin studies, and genetic studies also support animportant genetic contribution to disease predisposition(Holberg et al. 1999; Ober and Hoffjan 2006; Bouzigon etal. 2010; Thomsen et al. 2010). The prevalence of asthmavaries widely around the world (1–18 %), and predictionsfor the coming years indicate that an increase is expected forWestern societies (Braman 2006; Pearce et al. 2007). InSpain, the prevalence of asthma symptoms has been esti-mated around 5–6 %, with considerable geographic varia-tion among regions (5–12 %) (The Spanish Group of theEuropean Asthma Study 1995). However, the highest prev-alence of asthma in adults from Spain has been found in theCanary Islands (17.2 %), based on the European Communi-ty Respiratory Health Survey (The Spanish Group of theEuropean Asthma Study 1995; Julia Serda et al. 2005). Inaddition, estimates of asthma prevalence in children aged 6–7 years are twofold higher in the Canary Islands (18.4 %) thanthe mean for the Spanish population (9.9 %) (Sanchez-Lermaet al. 2009). Similarly, the prevalence of atopy in the CanaryIslands is also elevated (40.6 %), compared to the mainlandSpanish populations (Julia-Serda et al. 2011).
The Canary Islands belong politically to Spain, in spite ofbeing located at about 1,000 km from the closest Europeanpoint in Iberian Peninsula and only 100 km off the North-west coast of Africa. These islands were inhabited by ab-original people related to the Berber populations at the timeof Spanish occupation in the fifteenth century, as pointed byhistorical, anthropological, archeological, and linguisticrecords (Navarro 1991). Genetic footprints of such North-west African influence (as a proxy for the aborigines) inCanary Islanders have been demonstrated in contemporaryinhabitants using classical (Flores et al. 2001) and autosomal
markers (Maca-Meyer et al. 2004; Fregel et al. 2005;Pino-Yanes et al. 2011), as well as with mitochondrial DNA(Rando et al. 1999) and the Y chromosome (Flores et al.2003). Recently, we have estimated North African admixturein Canary Islanders using almost a hundred ancestry informa-tive markers (AIMs), genetic loci showing large allele fre-quency differences between populations, selected fromdifferent regions of the autosomal genome (Pino-Yanes et al.2011). Intriguingly, our results suggested that North Africanancestry averaged 17±25 %, but showed a wide interindivid-ual variation ranging from 0 to 96%, which was interpreted asa trace of the violent way the islands were conquered andcolonized (Pino-Yanes et al. 2011).
Although the prevalence of asthma is generally low with-in countries from West Africa, individuals with West Afri-can ancestry have shown a higher prevalence of asthma andrelated traits when exposed to a Western style of livingcompared to European descent populations (NHLBI 2004).This has been explained as a consequence of gene–environ-ment interaction by which the admixed African populationwould carry risk alleles for asthma and related traits becausethese alleles would provide them an adaptation to a higherload of parasites in their original populations that are nolonger present in the new environment (Le Souef et al.2006). As a consequence, in a recent admixed population,it is expected that genomic segments originated from theancestral ethnic group with the higher risk will be enrichedwith risk alleles (Smith et al. 2004), which will be reflectedin a larger proportion of ancestry from the ancestral popu-lation in affected individuals compared to the unaffectedgroup. This hypothesis has been confirmed for AfricanAmerican and African Caribbean individuals, in which alarger African admixture has been associated with highersusceptibility for asthma and related traits and with lowerpulmonary function measures (Tsai et al. 2006; Vergara etal. 2009; Kumar et al. 2010, 2012; Flores et al. 2012).Similar to the West African populations, the prevalence ofasthma is generally low in the North African countries(NHLBI 2004), being estimated in 3–4 % for clinical diag-nosed asthma in Algeria, Morocco, and Tunisia (Nafti et al.2009). However, a trend for a markedly increase of preva-lence has been found in these populations over recent dec-ades due to the acquisition of a Western lifestyle andcontinued urban shifts (NHLBI 2004). In fact, for Morocco,the highest prevalence of asthma and asthma symptoms, aswell as of other allergic diseases, is found in Casablanca, thelargest city and the economic capital (Bouayad et al. 2006).This prevalence has been associated with an increase inurbanization and the acquisition of urban life style of living(Bouayad et al. 2006). In line with this data, the geneticexpression profile in peripheral blood leukocytes has beenfound to be profoundly changed by an urban living stylecompared to a rural living style in Northwest African
706 Immunogenetics (2012) 64:705–711
Author's personal copy
populations (Idaghdour et al. 2008). Therefore, a higher riskfor asthma and related traits would be expected in popula-tions with North African genetic ancestry with Westernliving style.
Although the Canary Islands have particular climaticconditions that could promote the emergence of atopicsymptoms, it has been suggested that the genetic back-ground might also contribute to the high prevalence ofatopic symptoms and asthma in this population (Julia Serdaet al. 2005). Here, we aimed to analyze if genetic ancestry,assessed from autosomal AIMs, was associated with asthmaor related traits in a case–control sample of CanaryIslanders.
This study was approved by the ethics committees atparticipating hospitals, and written informed consent wasobtained from all subjects. This study was conducted usinga case–control design of 734 DNA samples from unrelatedindividuals reporting at least two generations of ancestorsborn in the Canary Islands. See Table 1 for the character-istics of subjects included in the study. Samples utilizedconstituted a subset of the Genetics of Asthma Study inthe Spanish population, described elsewhere (Pino-Yanes etal. 2012). Briefly, cases were represented by 391 physician-diagnosed asthmatic patients aged >5 years and fulfilling theGlobal Initiative for Asthma guidelines for diagnosis andclassification of asthma (http://www.ginasthma.com). Thesesamples were collected from respiratory medicine and allergydepartments from hospitals belonging to the Spanish NationalHealth System. Only individuals, who reported having at leasttwo generations of ancestors born in the Canary Islands, wereincluded in this study. Demographical and clinical data
recorded included: age, sex, smoking habits, age at diagnosisof the disease, rhinitis, atopic dermatitis, basal forced expira-tory volume in 1 s (FEV1), serum total IgE levels, and thesymptomatic treatment. Atopy was confirmed by a positiveskin prick test (SPT, a wheal with a diameter 3 mmgreater than the saline control) and/or elevated specificserum IgE levels (>0.35 UI mL−1) to at least one ofseven common allergens. Particularly, allergens evaluat-ed for specific IgE were: dust mite (Dermatophagoidespteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Glycyphagusspp, Blomia tropicalis, Acarus siro, Tyrophagus putres-centiae, Lepidoglyphus destructor, and Euroglyphusmaynei), epithelium (Felis domesticus, Canis familiaris,Equus caballus, and Oryctolagus cuniculus), pollen(Olea europaea, Salsola spp, Lolium perenne, Artemisiavulgaris, Parietaria spp, Platanus spp, Chenopodiumspp, Plantago spp, Rumex spp, and Cupressus spp),fungi (Penicillium notatum, Alternaria alternate, Asper-gillus fumigatus, and Cladosporium herbarum), food(Cow's milk, hen's egg, peanut, soybean, wheat, fish,shrimp, crabs, lobster, clams, oysters, mussels, banana, chest-nut, and kiwi), latex and cockroaches (Blattella germanica).
Controls consisted of 343 DNA samples from nonasth-matic unrelated adults, which were obtained from blood bankdonors who did not report a personal or familiar medicalhistory for allergic or pulmonary diseases and self-reportingat least two generations of ancestors born in the CanaryIslands. A total of 93 European AIMs (from now on referredas EuroAIMs), allowing to distinguish between North Africanand Iberian ancestries, were genotyped in cases and controlsusing iPLEX™ Gold assays on MassARRAY system by the
Table 1 Relevant demographicand clinical features of samples
In parentheses, total number ofsubjects with available data
NA not available, P25 percentile25, P75 percentile 75aχ2 testbMann–Whitney U test
Variable Cases (n0391) Controls (n0343) p Value
Gender (% of males) 37.4 (387) 62.6 (343) <0.001a
Age (years); mean, P25–P75 38, 22–48 (352) 36, 31–45 (343) 0.087b
Smoking habits (% of ever smokers) 20.8 (126) 79.2 (234) <0.001a
Clinical features
Serum IgE levels (kUI mL−1); mean, P25–P75 499.1, 89.3–425.5 (163) NA
Age at diagnosis (years); mean, P25–P75 24, 10–32 (356) NA
FEV1 (% predicted); mean, P25–P75 81, 67–95 (206) NA
Rhinitis (% positive) 44.9 (273) NA
Dermatitis (% positive) 4.0 (273) NA
SPT (% positive) 60.4 (240) NA
Specific IgE (% positive) 42.7 (225) NA
Atopy (% positive) 61.7 (256) NA
Treatment
Inhaled corticoids (%) 86.5 (222) NA
Oral corticoids (%) 2.9 (279) NA
Long-acting β2-agonists (%) 53.3 (291) NA
Short-acting β2-agonists (%) 81.5 (205) NA
Immunogenetics (2012) 64:705–711 707
Author's personal copy
Spanish National Genotyping Center, Santiago de Compos-tela Node (CeGen, http://www.cegen.org/) (Pino-Yanes et al.2011). Briefly, iPLEX™ assays were scanned by MALDI-TOF mass spectrometry, and individual SNP genotype callswere automatically generated using Sequenom Typer 3.4™software. Samples from the Coriell Institute for Medical Re-search (http://www.coriell.org) were included to test allelecalling reliability of this platform.
Departures from Hardy–Weinberg equilibrium (HWE)were evaluated separately in cases and controls using anexact test (Wigginton et al. 2005), by means of the SNPIn-fostats software (Pino-Yanes et al. 2011). Given its higherdiscriminatory power to detect differences among closelyrelated populations, such as North Africans and Iberians(Maca-Meyer et al. 2004), than alternative algorithms basedon the assignation of individuals to discrete populations(Heath et al. 2008; Li and Yu 2008; Price et al. 2008),principal component analysis (PCA) was utilized to deriveindividual ancestry estimates as scores of the first principalcomponent as the major axis covering the Iberian-NorthAfrican genetic differences (Pino-Yanes et al. 2011). Forthis purpose, data for the same set of EuroAIMs fromindividuals, self-declaring two generations of ancestorsfrom the Iberian Peninsula (n0889) and Morocco in NorthAfrica (n068), were jointly analyzed with the case–controlsample to serve as reference populations (Pino-Yanes et al.2011). EIGENSOFT was used to assess PCA and to test theassociation of ancestry estimates with asthma and atopic traitsbetween cases and controls by means of ANOVA statistics(Price et al. 2006). Then, in order to adjust this association,clinical and demographic variables were included as covari-ates along with ancestry estimates in regression models utiliz-ing SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Given that geneticancestry estimates represented a mean value from the genome,we also explored the possibility of having local differences ingenetic ancestry that could be detected by using the individualEuroAIMs as proxies. For that, SNPassoc (Gonzalez et al.2007) was employed to test the association of individualEuroAIMs with asthma, adjusting for the genetic ancestryestimates by means of logistic regression models. Finally, inorder to limit the expected proportion of false positives in-curred in the study when a particular individual EuroAIMassociation test was called significant and to account for themultiple phenotypes tested for association with genetic ances-try, a false discovery rate was computed using QVALUE(Storey and Tibshirani 2003), and a threshold q value of0.05 was established to declare significance.
Eight SNPs gave poor-quality genotype data duringgenotyping (rs1032143, rs1073321, rs12502036,rs1364394, rs153595, rs1854226, rs2171209, andrs7108371) and were discarded from the study. In addition,two SNPs that deviated significantly from HWE, after con-sidering a multiple correction threshold of p<6x10-4 (0.05/85)
at least in one study sample (rs7277342 and rs2596501), werealso dropped from the analyses. Therefore, further analysesincluded the remaining 83 EuroAIMs, which had an averagecompletion rate of 98.0 % (P25–P75097.5–98.6 %), for a totalof 734 samples (mean sample completion rate098.0 %, P25–P75098.8–100.0%). As previous findings have showed a highcorrelation between individual ancestry estimates obtainedwith the full set of 93 EuroAIMs and with a reduced subsetof as few as 65 markers (Pino-Yanes et al. 2011), the finalnumber of EuroAIMs considered was still adequate for thepurpose of the study. See Table S1 in the Online Resource forfurther details.
The comparison of genetic ancestries between asthmaticor atopic asthma patients with the control group did notreveal significant differences. Similarly, no association wasfound between genetic ancestry and a positive result neitherfor atopy, SPT or rhinitis (Table 2), nor with serum levels oftotal IgE or with pulmonary function, measured by thepercentage of predicted FEV1 (Table 2). Genetic ancestrywas associated at nominal significance with a positive resultfor specific IgE among asthmatics (p00.004) (Table 2).Although this comparison was still significant after consider-ing all traits tested (q00.032), this result was considerednonsignificant after adjusting for age as a covariate (p00.056). We further explored the effect of age by subdividingthe sample according to age quartiles (Q): ≤23 years (Q1), 24–32 years (Q2), 33–44 years (Q3), and >44 years (Q4). Theresults were not significant in any of the age groups, and thedirectionality of effects was different between subsamples,particularly between the group of individuals with ≤23 yearsversus all the rest of analyzed groups (≥24 years) (Table S2 inthe Online Resource). In fact, genetic ancestry was signifi-cantly associated with a positive result for specific IgE amongasthmatics with ≥24 years (p value00.008 and beta0−29.82).This result may point to a modifier effect of age in the associ-ation of genetic ancestry with a positive result for specific IgEamong asthmatics. While several evidences suggest that demo-graphic and environmental factors influence total and specificIgE, and that specific IgE levels decrease with the increasing ofage (Omenaas et al. 1994; Borish et al. 2005), due to the limitedpower to detect association after sample was subdivided(<22 % on each subsample), future studies with larger samplesizes would be needed to determine if such effect is genuine.
Despite no evidence of association was found betweengenetic ancestry and asthma risk among Canary Islanders,we then determined whether any of the individual Euro-AIMs was associated with asthma. Adjusting the associationof each marker by ancestry differences between patients andcontrols, seven EuroAIMs were nominally associated(0.005≤p value≤0.042), although none of these associationswas considered significant in the context of the multiplecomparisons performed (0.221≤q value≤0.443) (Table S3in the Online Resource).
708 Immunogenetics (2012) 64:705–711
Author's personal copy
In this study, we have explored for the first time whethergenetic ancestry in Canary Islanders was associated withasthma and related traits. Despite the high prevalence ofasthmatic and atopic symptoms estimated for this popula-tion compared to the rest of populations from Spain (JuliaSerda et al. 2005), no association was found between genet-ic ancestry and asthma or related traits in Canary Islanders.Similarly, none of the individual EuroAIMs showed associ-ations with asthma. These results are in agreement withprevious observations based on self-reported informationfrom grandparental place of birth, where subjects with twogenerations of ancestors born in the Canary Islands did notshow increased asthma risk when compared with subjectswith ancestors born elsewhere (Julia Serda et al. 2005).
Although the Canary Islands have particular climaticconditions, such as high humidity and stable warm temper-atures that provide ideal conditions for mites and molds,which favor the emergence of atopic and asthmatic symp-toms in the Canary Islands (Sanchez-Lerma et al. 2009),genetic factors are also be involved in this disease. Accord-ing to the hygiene hypothesis (Strachan 1989), we speculat-ed that genetic African ancestry in the Canary Islanderscould provide a higher risk for asthma and atopy becausethe African ancestral population would have adapted to apathogen-rich environment that no longer exists in the cur-rent urban society in the Canary Islands. In line with this, arecent study has shown that the pathogenic environment(mostly the exposure to helminthes) is the predominant driverof local adaptation, even stronger than climate (Fumagalli etal. 2011). In addition, allele frequencies in genes involved inimmunity response have been strongly correlated with patho-genic environment (Fumagalli et al. 2011). Remarkably, it hasbeen revealed that several genes associated at the genome-wide level with helminth diversity were also associated withsusceptibility for asthma and atopy (Fumagalli et al. 2010).Under this scenario, the helminth-driven selective pressure isexpected to favor individuals carrying alleles that allow a
strong Th2 response and, therefore, to promote the transmis-sion and spread of asthma-susceptibility variants (Fumagalli etal. 2010).
Previous studies have examined the association of genet-ic ancestry and asthma susceptibility in recently admixedpopulations, observing a difference of 5–6 % in Africanancestry between cases and controls in independent Africandescent populations from the USA and the Caribbean(Vergara et al. 2009; Flores et al. 2012). Our statistical powerwas adequate (≥80 %) to detect differences in North Africanadmixture between cases and controls with effects even lowerthan the previously observed (up to 3.2 % of differences inNorth African admixture, i.e., a standardized effect of ≥0.2)(Fig. 1). However, in the hypothetical case that the geneticancestry had a true association with susceptibility to asthma orrelated traits, the presence of smaller effects cannot be dis-carded. Similarly, it is likely that the use of a larger number ofmarkers will allow estimating further ancestries among
Table 2 Association betweengenetic ancestry and asthmaticand atopic phenotypes
aLogistic regression model in-cluding gender and smokinghabits as covariatesbLogistic regression model in-cluding the age as a covariatecLinear regression model includ-ing the age as a covariate
Clinical variable Association p value (q value) Beta
Unadjusted Adjusted
Cases versus controls
Asthma 0.379 (0.599) 0.667a (0.889) −3.21
Atopic asthma 0.501 (0.599) 0.861a (0.958) 1.53
Asthmatic patients
Atopy (positiveness) 0.408 (0.599) 0.473b (0.889) −5.96
SPT (positiveness) 0.363 (0.599) 0.344b (0.889) −7.99
Rhinitis (positiveness) 0.137 (0.548) 0.452b (0.889) 6.51
Specific IgE (positiveness) 0.004 (0.032) 0.056b (0.448) −18.66
Total IgE levels (log scale) 0.524 (0.599) 0.958c (0.958) −0.13
FEV1 (%) 0.609 (0.609) 0.576c (0.889) 43.95
Fig. 1 Statistical power to detect differences in the genetic ancestryproportions by standardized effects for the sample size utilized (391cases and 343 controls)
Immunogenetics (2012) 64:705–711 709
Author's personal copy
Canary Islanders. In this study, samples from different loca-tions in Morocco were used as a proxy for the aboriginalpopulation inhabiting the Canary Islands before the conquest.Although this is a reasonable assumption given the evidencefrom the historical records (Chejne 1974; Flores et al. 2001)and the numerous previous genetic studies (Rando et al. 1999;Flores et al. 2001, 2003, 2004; Alonso et al. 2005; Adams etal. 2008; Fregel et al. 2009), this obviously constitutes asimplification of the heterogeneous African influences thathave affected the Canary Islands populations. Therefore, it islikely that further sampling of North African regions and thetyping of additional markers might allow identifying othergenetic influences in Canary Islanders, which could clarify ifa true relationship between genetic ancestry and asthma existsin this population. In addition, another limitation of this studyis that the socioeconomic status of individuals was notrecorded, and therefore, its effects on asthma risk were notexplored. Given that the Spanish National Health Systemguarantees free healthcare access to the whole population,not only for treatment and rehabilitation but also for thepromotion of health and prevention of disease, a limited effecton asthma risk is expected.
In conclusion, no association was found between geneticancestry and asthma or related traits among Canary Islanders.Larger studies examining more genetic variants would beneeded to explore whether genetic ancestry has modest effectsin increasing asthma risk in the Canary Islanders.
Acknowledgments We thank David Comas and Jose M. Larruga forproviding Northwest African samples. This work was supported bygrants from the Health Institute “Carlos III” (FIS PI08/1383, FIS PI11/00623) and cofinanced by the European Regional Development Funds,“Away of making Europe” from the European Union, by a grant fromFundación Canaria de Investigación y Salud (FUNCIS 27/07), and by aspecific agreement between Instituto de Salud Carlos III and Gobiernode Canarias (EMER07/001).
Conflict of interest None.
References
Adams SM, Bosch E, Balaresque PL, Ballereau SJ, Lee AC, Arroyo Eet al (2008) The genetic legacy of religious diversity and intoler-ance: paternal lineages of Christians, Jews, and Muslims in theIberian Peninsula. Am J Hum Genet 83:725–736
Alonso S, Flores C, Cabrera V, Alonso A, Martin P, Albarran C et al(2005) The place of the Basques in the European Y-chromosomediversity landscape. Eur J Hum Genet 13:1293–1302
Borish L, Chipps BE, Deniz Y, Zheng B, Dolan C (2005) Total serumIgE levels in a large cohort of subjects with severe or difficult totreat asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 95:247–253
Bouayad Z, Aichane A, Afif A, Benouhoud N, Trombati N, Chan-YeungM et al (2006) Prevalence and trend of self-reported asthma andother allergic disease symptoms inMorocco: ISAAC phase I and III.Int J Tuberc Lung Dis 10:371–377
Bouzigon E, Forabosco P, Koppelman GH, Cookson WO, Dizier MH,Duffy DL et al (2010) Meta-analysis of 20 genome-wide linkage
studies evidenced new regions linked to asthma and atopy. Eur JHum Genet 18:700–706
Braman SS (2006) The global burden of asthma. Chest 130:4S–12SChejne A (1974) Muslim Spain. Its history and culture. University of
Minnesota, MinneapolisFlores C, Larruga JM, Gonzalez AM, Hernandez M, Pinto F, Cabrera
VM (2001) The origin of the Canary Island aborigines and theircontribution to the modern population: a molecular genetics per-spective. Curr Anthropol 42:749–755
Flores C, Maca-Meyer N, Perez JA, Gonzalez AM, Larruga JM,Cabrera VM (2003) A predominant European ancestry of paternallineages from Canary Islanders. Ann Hum Genet 67:138–152
Flores C, Maca-Meyer N, Gonzalez AM, Oefner PJ, Shen P, Perez JAet al (2004) Reduced genetic structure of the Iberian peninsularevealed by Y-chromosome analysis: implications for populationdemography. Eur J Hum Genet 12:855–863
Flores C, Ma SF, Pino-Yanes M, Wade MS, Perez-Mendez L, KittlesRA et al (2012) African ancestry is associated with asthma risk inAfrican Americans. PLoS ONE 7:e26807
Fregel R, Maca-Meyer N, Cabrera VM, Gonzalez AM, Larruga JM(2005) Description of a simple multiplex PCR-SSCP method forAB0 genotyping and its application to the peopling of the CanaryIslands. Immunogenetics 57:572–578
Fregel R, Gomes V, Gusmao L, Gonzalez AM, Cabrera VM, AmorimA et al (2009) Demographic history of Canary Islands male gene-pool: replacement of native lineages by European. BMC EvolBiol 9:181
Fumagalli M, Pozzoli U, Cagliani R, Comi GP, Bresolin N, Clerici Met al (2010) The landscape of human genes involved in theimmune response to parasitic worms. BMC Evol Biol 10:264
Fumagalli M, Sironi M, Pozzoli U, Ferrer-Admettla A, Pattini L,Nielsen R (2011) Signatures of environmental genetic adaptationpinpoint pathogens as the main selective pressure through humanevolution. PLoS Genet 7:e1002355
Gonzalez JR, Armengol L, Sole X, Guino E, Mercader JM, Estivill Xet al (2007) SNPassoc: an R package to perform whole genomeassociation studies. Bioinformatics 23:644–645
Heath SC, Gut IG, Brennan P, McKay JD, Bencko V, Fabianova E et al(2008) Investigation of the fine structure of European populationswith applications to disease association studies. Eur J Hum Genet16:1413–1429
Holberg CJ, Halonen M, Wright AL, Martinez FD (1999) Familialaggregation and segregation analysis of eosinophil levels. Am JRespir Crit Care Med 160:1604–1610
Idaghdour Y, Storey JD, Jadallah SJ, Gibson G (2008) A genome-widegene expression signature of environmental geography in leuko-cytes of Moroccan Amazighs. PLoS Genet 4:e1000052
Julia Serda G, Cabrera Navarro P, Acosta Fernandez O, Martin Perez P,Batista Martin J, Alamo Santana F et al (2005) High prevalence ofasthma symptoms in the Canary Islands: climatic influence? JAsthma 42:507–511
Julia-Serda G, Cabrera-Navarro P, Acosta-Fernandez O, Martin-PerezP, Losada-Cabrera P, Garcia-Bello MA et al (2011) High preva-lence of asthma and atopy in the Canary Islands, Spain. Int JTuberc Lung Dis 15:536–541
Kumar R, SeiboldMA, AldrichMC,Williams LK, Reiner AP, ColangeloL et al (2010) Genetic ancestry in lung-function predictions. N EnglJ Med 363:321–330
Kumar R, Tsai HJ, Hong X, Gignoux C, Pearson C, Ortiz K et al(2012) African ancestry, early life exposures, and respiratorymorbidity in early childhood. Clin Exp Allergy 42:265–274
Le Souef PN, Candelaria P, Goldblatt J (2006) Evolution and respira-tory genetics. Eur Respir J 28:1258–1263
Li Q, Yu K (2008) Improved correction for population stratification ingenome-wide association studies by identifying hidden popula-tion structures. Genet Epidemiol 32:215–226
710 Immunogenetics (2012) 64:705–711
Author's personal copy
Maca-Meyer N, Villar J, Perez-Mendez L, Cabrera de Leon A, FloresC (2004) A tale of aborigines, conquerors and slaves: Alu inser-tion polymorphisms and the peopling of Canary Islands. AnnHum Genet 68:600–605
Nafti S, Taright S, El Ftouh M, Yassine N, Benkheder A, Bouacha H etal (2009) Prevalence of asthma in North Africa: the AsthmaInsights and Reality in the Maghreb (AIRMAG) study. RespirMed 103(Suppl 2):S2–S11
National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI) (2004) Globalburden of asthma. National Institutes of Health, Bethesda
Navarro J (1991) El poblamiento prehistórico. In: Morales-Padrón F(ed) Historia de Canarias. Prensa Ibérica, Madrid, pp 41–60
Ober C (2005) Perspectives on the past decade of asthma genetics. JAllergy Clin Immunol 116:274–278
Ober C, Hoffjan S (2006) Asthma genetics 2006: the long and windingroad to gene discovery. Genes Immun 7:95–100
Omenaas E, Bakke P, Elsayed S, Hanoa R, Gulsvik A (1994)Total and specific serum IgE levels in adults: relationship tosex, age and environmental factors. Clin Exp Allergy24:530–539
Pearce N, Ait-Khaled N, Beasley R, Mallol J, Keil U, Mitchell E,Robertson C (2007) Worldwide trends in the prevalence of asthmasymptoms: phase III of the International Study of Asthma andAllergies in Childhood (ISAAC). Thorax 62:758–766
Pino-Yanes M, Corrales A, Basaldúa S, Hernández A, Guerra L, VillarJ, Flores C (2011) North African influences and potential bias incase–control association studies in the Spanish population. PLoSONE 6:e18389
Pino-Yanes M, Sanchez-Machin I, Cumplido J, Figueroa J, Torres-GalvanMJ, Gonzalez R et al (2012) IL-1 receptor-associated kinase 3 gene(IRAK3) variants associate with asthma in a replication study in theSpanish population. J Allergy Clin Immunol 129:573-575, 575.e1-e10
Price AL, Patterson NJ, Plenge RM, Weinblatt ME, Shadick NA,Reich D (2006) Principal components analysis corrects forstratification in genome-wide association studies. Nat Genet38:904–909
Price AL, Butler J, Patterson N, Capelli C, Pascali VL, Scarnicci F et al(2008) Discerning the ancestry of European Americans in geneticassociation studies. PLoS Genet 4:e236
Rando JC, Cabrera VM, Larruga JM, HernandezM, Gonzalez AM, PintoF, Bandelt HJ (1999) Phylogeographic patterns ofmtDNA reflectingthe colonization of the Canary Islands. Ann HumGenet 63:413–428
Sanchez-Lerma B, Morales-Chirivella FJ, Penuelas I, Blanco GuerraC, Mesa Lugo F, Aguinaga-Ontoso I, Guillen-Grima F (2009)High prevalence of asthma and allergic diseases in children aged 6and 7 years from the Canary Islands: the International Study ofAsthma and Allergies in Childhood. J Investig Allergol ClinImmunol 19:383–390
Smith MW, Patterson N, Lautenberger JA, Truelove AL, McDonaldGJ, Waliszewska A, Kessing BD, Malasky MJ, Scafe C, Le E et al(2004) A high-density admixture map for disease gene discoveryin African Americans. Am J Hum Genet 74:1001–1013
Storey JD, Tibshirani R (2003) Statistical significance for genomewidestudies. Proc Natl Acad Sci U S A 100:9440–9445
Strachan DP (1989) Hay fever, hygiene, and household size. BMJ299:1259–1260
The Spanish Group of the European Asthma Study (1995) The Euro-pean Asthma Study. The prevalence of asthma-related symptomsin 5 Spanish areas. Med Clin (Barc) 104:487–492
Thomsen SF, van der Sluis S, Kyvik KO, Skytthe A, Backer V (2010)Estimates of asthma heritability in a large twin sample. Clin ExpAllergy 40:1054–1061
Tsai HJ, Kho JY, Shaikh N, Choudhry S, Naqvi M, Navarro D et al(2006) Admixture-matched case–control study: a practical ap-proach for genetic association studies in admixed populations.Hum Genet 118:626–639
Vergara C, Caraballo L, Mercado D, Jimenez S, Rojas W, Rafaels N etal (2009) African ancestry is associated with risk of asthma andhigh total serum IgE in a population from the Caribbean Coast ofColombia. Hum Genet 125:565–579
Wigginton JE, Cutler DJ, Abecasis GR (2005) A note on exact tests ofHardy–Weinberg equilibrium. Am J Hum Genet 76:887–893
Immunogenetics (2012) 64:705–711 711
Author's personal copy
Assessing the Validity of Asthma Associations for EightCandidate Genes and Age at Diagnosis EffectsMarıa Pino-Yanes1,2¤, Almudena Corrales1,2, Jose Cumplido3, Paloma Poza4,
Inmaculada Sanchez-Machın4, Anselmo Sanchez-Palacios5, Javier Figueroa5,
Orlando Acosta-Fernandez6, Nisa Buset7, Jose Carlos Garcıa-Robaina8, Mariano Hernandez9,
Jesus Villar1,7,10, Teresa Carrillo3, Carlos Flores1,2,9*
1 Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain, 2 Research Unit, Hospital Universitario
Nuestra Senora de Candelaria, Santa Cruz de Tenerife, Spain, 3 Allergy Unit, Hospital Universitario Dr. Negrın, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 4 Allergy Management
Unit, Hospital del Torax (Ofra), Santa Cruz de Tenerife, Spain, 5 Allergy Unit, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 6 Neumology
Unit, Hospital Universitario de Canarias, San Cristobal de La Laguna, Spain, 7 Research Unit, Hospital Universitario Dr. Negrin, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 8 Allergy
Unit, Hospital Universitario Nuestra Senora de Candelaria, Santa Cruz de Tenerife, Spain, 9 Applied Genomics Group (G2A), Genetics Laboratory, Instituto Universitario de
Enfermedades Tropicales y Salud Publica de Canarias, Universidad de La Laguna, San Cristobal de La Laguna, Spain, 10 Keenan Research Center, St. Michael’ Hospital,
Toronto, Ontario, Canada
Abstract
Background: Before the advent of genome-wide association studies (GWAS), ADAM33, ADRB2, CD14, MS4A2 (alias FCER1B),IL13, IL4, IL4R, and TNF constituted the most replicated non-HLA candidate genes with asthma and related traits. However,except for the IL13-IL4 region, none of these genes have been found in close proximity of genome-wide significant hitsamong GWAS for asthma or related traits. Here we aimed to assess the reproducibility of these asthma associations and totest if associations were more evident considering the effect of age at diagnosis.
Methodology/Principal Findings: We systematically evaluated 286 common single nucleotide polymorphisms (SNPs) ofthese 8 genes in a sample of 1,865 unrelated Spanish individuals (606 asthmatics and 1,259 controls). We found that variantsat MS4A2, IL4R and ADAM33 genes demonstrated varying association effects with the age at diagnosis of asthma, with 10SNPs showing study-wise significance after the multiple comparison adjustment. In addition, in silico replication with GWASdata supported the association of IL4R.
Conclusions/Significance: Our results support the important role of MS4A2, IL4R and ADAM33 genes in asthma and/oratopy susceptibility. However, additional studies in larger samples sets are needed to firmly implicate these genes in asthmasusceptibility, and also to identify the causal variation underlying the associations found.
Citation: Pino-Yanes M, Corrales A, Cumplido J, Poza P, Sanchez-Machın I, et al. (2013) Assessing the Validity of Asthma Associations for Eight Candidate Genesand Age at Diagnosis Effects. PLoS ONE 8(9): e73157. doi:10.1371/journal.pone.0073157
Editor: Gualtiero I. Colombo, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, Italy
Received February 13, 2013; Accepted July 18, 2013; Published September 9, 2013
Copyright: � 2013 Pino-Yanes et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: Funded by grants from the Carlos III Health Institute (http://www.isciii.es) and cofounded by the European Regional Development Fund (FEDER) "A wayof making Europe": PI081383 and EMER07/001, and by a grant from Fundacion Canaria de Investigacion y Salud FUNCIS 27/07 (http://www.funcis.org) to CF. MPYwas funded by a postdoctoral fellowship from Fundacion Ramon Areces (http://www.fundacionareces.es). The funders had no role in study design, data collectionand analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: cflores@ull.edu.es
¤ Current address: Department of Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, California, United States of America
Introduction
Asthma is a complex respiratory disease characterized by
chronic inflammation of the airways and frequently associated
with atopy, pulmonary obstruction and bronchial hyper-respon-
siveness against a diversity of stimulus [1]. Its prevalence varies
widely among different populations around the world (1–18%) [2].
Familiar clustering [3], twin studies [4], and genetic studies [5,6]
support an important genetic component of the disease, with an
estimated heritability of 60% [7].
Before the advent of genome-wide association studies (GWAS)
[8], almost a thousand candidate-gene association studies for
asthma and related traits were published [9]. Considering the gene
as the unit of replication and using a broad definition for asthma,
Ober & Hoffjan [5] elegantly summarized the accumulated
evidence for candidate-gene association studies from the literature
by assessing the consistency of findings [10]. This yielded a ranking
of candidate genes based on the number of positive associations
between any polymorphism and any asthma trait [5]. As a result,
eight non-HLA genes were put forward among the most replicated
(in .10 independent studies) and, therefore, these genes were
suggested as firm candidates for asthma susceptibility [5]. Four of
these genes were located in the linked region for asthma on
chromosome 5q: interleukin (IL) 4 (IL4), IL13, CD14 and the b2-
adrenergic receptor (ADRB2); one gene was located in the linked
region 6p21: the tumor necrosis factor (TNF); one was the first
PLOS ONE | www.plosone.org 1 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
positionally cloned asthma gene, ADAM metallopeptidase domain
33 (ADAM33); another was the gene encoding the a chain of the
IL-4 and IL-13 receptors (IL4R); and finally, the gene encoding the
IgE Fc receptor beta-subunit (MS4A2, alias FCER1B). However,
most of them were assessed in studies with limited sample sizes
averaging <200 individuals per group [5,11], and lacked of a
systematical analysis in candidate-gene studies by surveying more
than few variants (for example, by using tagging SNPs [tSNPs]).
To date, despite the fact that more than ten GWAS of asthma
have been published, none of these eight firm candidates have
been replicated at genome wide significance, nor have been found
in close proximity of GWAS hits, except for the IL13-IL4 region
[8,12–21].
Asthma is clinically recognized as an amalgam of several distinct
phenotypes [22,23], which blur the complex genetic architecture
underlying the disease susceptibility. Among these phenotypes, the
age-at-onset of asthma could differentiate asthmatic groups, so that
genetic variants might inconsistently associate with childhood and
later-onset disease [17,24,25]. Motivated by this evidence, here we
aimed to assess the reliability of asthma associations for the eight
most replicated non-HLA asthma candidate genes and to explore
whether effects of risk alleles varied with the disease age at
diagnosis.
Methods
Ethics statementThis study was approved by the External Scientific Committee
and Advisory Committee of Experts on ethical, economic,
environmental, legal and social affairs at the National Bank and
the Ethics Committee of Hospital Universitario NS de Candelaria
and Hospital Universitario Doctor Negrın. Written informed
consent was obtained from all subjects or appropriate surrogates
on the behalf of participants under the age of 18.
Study subjectsThis study was conducted using a case-control design of 1,878
DNA samples from unrelated individuals, all reporting at least two
generations of Spanish descent. Sample details have been
described elsewhere [24]. In brief, cases included 607 asthmatic
patients aged .5 years and diagnosed by physicians following the
Global Initiative for Asthma (GINA) guidelines for diagnosis and
classification of asthma severity (http://www.ginasthma.com).
These samples were collected and characterized for allergic and
asthmatic symptoms in Respiratory Medicine and Allergy
Departments, as part of the Genetics of Asthma study (GOA) in
the Spanish population. Among cases, atopy was defined by the
evidence of allergic sensitization to known allergens, reflected by
either a positive skin prick test [SPT] or the specific IgE to one or
more known allergens in the serum. For simplicity, those cases that
had asthma and also atopy will be referred as atopic asthmatics,
although we ignored whether or not allergen exposures lead to the
asthma symptoms of these patients. Further sample details can be
found in Text S1 and in Table S1.
Control group consisted of 1,271 DNA samples from adults self-
reporting no personal or familiar medical history of allergic or
pulmonary diseases recruited from the Spanish National DNA
Biobank. These were collected from branches of the National
Blood Service from unrelated individuals residing in Spain. After
signed informed consent, by means of personal interviews, each
donor was asked to declare general health status, physic activity,
commonly used transportation, nutrition habits, type of work and
qualification, demographics, tobacco smoke, alcohol consumption,
genealogical information, residence and mother tongue, and
personal and familial history of diseases. See http://www.
bancoadn.org for further information. In addition to the criteria
of the Spanish National DNA Biobank to define healthy controls,
we added three more criteria to select the controls for this study: 1)
Self-reported Spanish ancestry based on having at least two
generations of ancestors born in Spain; 2) Complete data on
personal and familiar history of disease recorded in the
questionnaire, smoking status, place of origin, and area of
residence; 3) Absence of self-reported personal or familiar history
of pulmonary or allergic disease. Further sample details can be
found in Text S1 and in Table S1.
Selection of tagging SNPsTagging SNPs (tSNPs) were selected by means of TagIT 3.03
[26], using available re-sequencing data from European samples
from different sources (Table 1 and Table S2). The IL13 and IL4
genes, which lie in close proximity, were considered as a single
region. Similarly, given the strong linkage disequilibrium (LD)
between LTA and TNF genes [27], common variants of the LTA
gene were also tagged and jointly analyzed with TNF. See Text S1
and Table S2 for further details.
Assessment of population stratificationTo reduce the risk for false positives due to major population
stratification effects, a total of 83 European ancestry informative
markers (termed EuroAIMs) were determined in case and control
samples. These EuroAIMs allowed to correct for major differences
in Spanish populations due to the North African genetic influences
observed in this population, with a mean value of 5–9% for
mainland populations and 16–20% for Canary Islanders [28]. A
principal component analysis (PCA) based on these genetic
markers was used to derive the ancestry estimates in cases and
controls as scores of the first principal component (PC1), by means
of EIGENSOFT [29]. A full list of EuroAIMs used and the
genotyping procedures have been detailed elsewhere [24,28].
GenotypingGenotyping was conducted using the iPLEXH Gold assay on
MassARRAYH system (Sequenom Inc., San Diego, CA) by the
Spanish National Genotyping Center, Santiago de Compostela
Node (CeGen, http://www.cegen.org). Briefly, iPLEXH assays
were scanned by MALDI-TOF mass spectrometry and individual
SNP genotype calls were automatically generated using Sequenom
TYPER 3.4H software (Sequenom Inc.). Samples from the Coriell
Institute for Medical Research (http://www.coriell.org) were
included on each SpectroCHIPH (Sequenom Inc.) to test allele
calling reliability samples of this platform. The SNPs that gave
poor quality data on this platform were finally determined at the
Hospital Universitario N. S. de Candelaria using either SNaP-
shotH Multiplex kit reactions (Applied Biosystems, Foster City,
CA) or KASPar SNP Genotyping System assays (KBiosciences,
Hertfordshire, UK). Genotyping was blind to the disease status
and <6% of the samples were genotyped in duplicate to monitor
genotyping quality. See Text S1 for further details.
Statistical analysisClinical and demographical data were analyzed by means of the
x2-test and the Mann-Whitney U-test using R version 2.15 [30].
Departures from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) were
evaluated separately for cases and controls using an exact test
[31], by means of a custom script for STATISTICA (StatSoft Inc.,
Tulsa, OK) [32]. However, as deviations in cases have been
considered a symptom of disease association [33–35], only those
Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes
PLOS ONE | www.plosone.org 2 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
tSNPs deviating significantly from HWE in the control group were
filtered out from further analyses (threshold p-value = 7.0E-04
after considering the multiple comparisons performed). Individual
tSNP associations were tested under an additive model by means
of regression analysis with SNPassoc [36]. For that, PC1 scores
were included as a covariate in regression models to adjust
associations for population stratification, and allele effects were
estimated as odds ratios (ORs) with 95% confidence intervals (CIs).
Additionally, MaCH 1.0 [37] was used to impute untyped SNPs
with data from 380 European individuals deposited in The 1000
Genomes Project (1KGP), May 2011 version [38]. Association
testing was performed using Mach2dat [37] adjusting for the PC1
scores. This analysis was conducted using allele dosages for those
SNPs showing MAF$10% and Rsq.0.3, ensuring that all SNPs
considered for association testing were accurately imputed (with
.90% of SNPs having Rsq.0.8, and with a mean Rsq across all
imputed SNPs of 0.95 [IQR: 0.91–0.97]) (Table S3).
For each gene by separate, a conditional regression-based
analysis was used to point out the independent association signals
of each locus by including all SNPs associated at nominal
significance. We then tested if association tests of the SNPs that
represented nominal independent associations within each gene
improved considering age-at-onset-varying effects, by implement-
ing a sequential addition (SA) of cases [39]. For that, the age at
diagnosis was utilized as a proxy for the age-at-onset of the disease,
which was not recorded for most patients, and cases were grouped
in categories of quartiles of age (14 [n = 155], 26 [n = 291], 39
[n = 427], and 82 years [n = 606]). The age at diagnosis cutoff
obtained was next used to select a sub-sample of cases for which
associations were tested again, both for tSNPs and imputed SNPs.
LD patterns and regional association results were represented
using LocusZoom 1.1 based on LD data from hg18 deposited by
1KGP [40].
To judge the significance of SNP associations in the context of
the multiple comparisons performed, a false discovery rate (FDR)
was calculated using QVALUE [41]. A FDR threshold of 5% (p-
value #0.0012) was established to declare study-wise significance
to limit the expected proportion of false positives incurred in the
study when a particular individual SNP test was called significant.
This was assessed considering altogether the p-values from all
SNPs analyzed, both genotyped and imputed, the tests from the
SA of cases to obtain the age cutoff at which the allele effects were
largest, and all the comparisons performed (i.e. associations with
asthma, atopic asthma, and age-of-onset before the cutoffs).
Functional annotation of associated SNPs was carried out using
the software HaploReg [42].
Results
A total of 13 samples (1 case and 12 controls) were excluded
from the analyses because of genotype quality (completion rate
,90%). Out of the initial set of 82 tSNPs, 6 were found
monomorphic (rs5744440, rs35684381, rs597040, rs8124875,
rs614971 and rs17548816) by using both iPLEXH and an
alternative genotyping method (see the Supplementary methods
in Text S1). Only one tSNP (rs12361312 at MS4A2) deviated
significantly from HWE expectations in the control group and was
discarded from further analyses (Table S2). Therefore, a total of
75 tSNPs, which maintained an adequate coverage for all genes
(r2$0.85), and 211 imputed SNPs were considered for association
studies in 1,865 samples (606 cases and 1,259 controls) (Table S3).
The mean completion rate among the 75 tSNPs was 98.5% (P25–
P75 = 98.7–100.0%), and the estimated overall genotype dis-
cordance rate among duplicated samples was 0.30% (95% CI =
0.08%–1.09%).
Association testing revealed a total of 35 SNPs (16 tSNPs and 19
imputed) that were associated with either asthma or atopic asthma
at nominal significance, although these were not considered
significant in the context of the multiple comparisons (p-values
.0.0012) (Table S3). Based on the premise that incorporating the
age-at-onset in the analyses might increase the power to detect
association [24,25], we next used SA of asthma patients to estimate
the age at diagnosis cutoff maximizing allele effects. For that,
among the 35 SNPs that reached nominal significance, we first
excluded the redundant SNPs from each gene using conditional
logistic regressions for asthma or atopic asthma. We identified the
following SNPs as the ones showing independent nominal
associations: rs1800925 (21112 C/T) in IL13–IL4 (only for atopic
asthma), rs2071590 in LTA-TNF (only for asthma), rs569108
(Gly237Glu) in MS4A2, and rs1805015 (Ser478Pro) in IL4R (both
for asthma and atopic asthma) and rs2787095 in ADAM33 (only
for asthma) (data not shown). These 5 SNPs represented
independent associations for each gene and coincidentally, these
Table 1. Summary information used for the selection of tagging SNPs (tSNPs) on the candidate genes.
Gene Chr. (Mb) Size (kb)Coveredregion (kb) Data sources
SelectedtSNPs Monomorphic
FinaltSNPs
Finalhaplotyper2
IL13–IL4 5q31.1 (132.0) 12 29.0 SeattleSNPsa 10 0 10 1.00
CD14 5q31.1 (140.0) 2 7.0 InnateImmunityb
6 1 5 1.00
ADRB2 5q31 (148.2) 2 9.5 SeattleSNPsa 8 1 7 1.00
TNF-LTA 6p21.3 (31.5) 6 9.3 SeattleSNPsa 11 0 11 0.85
MS4A2 11q13 (59.9) 10 15.3 HapMap/ T1Dc 7 0 7 0.97
IL4R 16p12.1 (27.3) 51 56.0 SeattleSNPsa 21 0 21 0.92
ADAM33 20p13 (3.6) 14 15.2 EGPd 19 4 15 1.00
Total 97 141.3 82 6 76
aThe National Heart Lung and Blood Institute’s (NHLBI) Programs for Genomic Applications (http://pga.gs.washington.edu).bThe Inate Immunity NHLBI Program for PGA (https://regepi.bwh.harvard.edu/IIPGA2).cHapMap phase 2 (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov) and data from 96 type 1 diabetes individuals [28].dThe NIEHS Environmental Genome Project (http://egp.gs.washington.edu).doi:10.1371/journal.pone.0073157.t001
Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes
PLOS ONE | www.plosone.org 3 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
5 SNPs had been associated with asthma or related traits in
previous studies, but in this study we extended their association to
a Southwestern European population with noticeable North
African influences.
SA did not show any age at diagnosis cutoff that significantly
maximized the association of rs1800925 (in IL13–IL4) with atopic
asthma (lowest p-perm = 0.063). In contrast, SA revealed allele
effects peaking at the same age at diagnosis, 39 years (number of
cases = 427), for SNPs from MS4A2 and IL4R: rs569108 in
MS4A2 (p-perm = 0.005), and rs1805015 in IL4R (p-perm = 0.001).
However, SA revealed allele effects peaking at a different age at
diagnosis for the SNPs from the other two genes: rs2071590 in
LTA-TNF showing a maximum at 26 years (p-perm = 0.002,
number of cases = 291), and rs2787095 in ADAM33 with a
maximum at 14 years (p-perm = 3.0E–04, number of cases =
155). The results obtained from the SA analyses using the quartiles
of the distribution of the age at diagnosis were equivalent to those
obtained using it as a continuous variable (data not shown).
Testing associations on the sub-sample of cases with the age at
diagnosis of asthma before the maxima determined by SA for each
gene revealed 18 additional SNPs reaching nominal significance
(Table S3). Five of these SNPs (0.013# p-value #0.050) were
located in IL4R gene and only one of them constituted a positive
finding in previous studies. After conditioning these new associ-
ations from IL4R to the SNP rs1805015, only one SNP showed
independent association (rs3024676, p-value = 0.021). The
remaining 13 were all SNPs from ADAM33 (3.8E-5# p-value
#0.039), and 6 of them have been associated in at least one
previous study (Table S3 and Figure 1). After adjusting the
association of these 13 SNPs in ADAM33 that emerged with the
age at diagnosis cutoff for the SNP rs2787095, 7 SNPs (rs2787093,
rs628965, rs628977, rs630712, rs598418, rs2853209, and
rs603112) resulted independently associated from this SNP
(0.012# p-value #0.048). Therefore, the advantages of taking
into account the age at diagnosis varying effects for replication
studies in asthma were clearly evidenced in ADAM33, a gene for
which SNP-level replications are scarce in the literature [5,43].
Otherwise, we would have missed .50% of SNPs of this gene that
showed association in previous studies. For the LTA-TNF and
MS4A2 genes, we only observed subtle increases of effect sizes for
the SNPs that were revealed in our previous analyses, but did not
evidence more SNPs reaching nominal significance (Table S3 and
Figure 1). After a global FDR assessment accounting for all
comparisons performed, only 10 SNPs in MS4A2, IL4R and
ADAM33 genes showed an FDR ,5%, which were considered
associated at study-wise significance (Table 2). Among these, 7
SNPs were identified to be functional, as they were either
predicted to cause missense changes in the protein encoded or
had empirically demonstrated regulatory roles as deduced from
ENCODE project experimental data [42] (Table S4).
In order to provide evidence for replication at these loci, we
accessed the GABRIEL data, the largest GWAS meta-analysis in
asthma performed in Europeans [17]. There, we were able to
allocate 11 out of the 51 SNPs that reached nominal significance
with asthma in our study (Table S5). Only the SNP rs1805012,
located in IL4R, demonstrated in silico replication in GABRIEL
(p = 5.7E-04), showing the same direction of effects as in our study.
Discussion
In this study, we have comprehensively analyzed the association
of 286 common variants of eight candidate genes with asthma and
atopic asthma in a case-control Spanish sample and found
associations for 10 SNPs in three of them (MS4A2, IL4R and
ADAM33) after considering all tests performed. We additionally
provided in silico replication for IL4R with GWAS data from the
GABRIEL study.
It is well known that the age-at-onset of asthma is associated
with different phenotypic characteristics [44], and it has recently
evidenced that age-varying genetic associations can cause non-
replication and, consequently, lead to missing important genetic
associations [45]. Therefore, here we re-evaluated the association
of these genes by restricting the analysis to case subjects with an
age at diagnosis of asthma before a cutoff that maximized allele
effects of replicated variants. This allowed us to verify that
association improved for certain genes, such as ADAM33, as
recently supported for other firm candidates [25,46,47], and also
to gain insight in the genetic complexity of asthma associations at
these candidate genes. Intriguingly, many of their effects peaked in
the range of age at diagnosis between 20 and 45 years,
coincidental with the age range with the maximum expression of
the disease [48,49]. It remains to be solved whether or not true
biological mechanisms underlie this and previous observations
[17,25,46]. Nevertheless, our results suggest that it will be worth
considering the disease age at diagnosis in further studies, as well
as in the research of improved asthma treatment and prevention.
To identify firm susceptibility genes and understand the
biological processes underlying the development of the disease,
replication in independent well-powered studies is essential,
regardless of whether the first evidence of association was provided
by a GWAS study or a candidate gene survey [50]. Besides,
replication efforts allow testing the generalizability of findings in
other populations, and discovering novel genetic loci contributing
to phenotypic trait variability [51]. Particularly, testing the
associations in populations of recent African ancestry will likely
improve the detection of new risk variants [52], as they may offer
the opportunity to refine the signal or to allocate the causal
variants [53]. Our study aligns with these considerations, as it was
performed in a population with sizeable North African genetic
influences [28,54], and with a sample size representing a
substantially larger population of cases (.97%) than the vast
majority of prior published case-control studies of these genes in
unrelated individuals, although still far from optimal to detect
weak effects.
Under a simplistic scenario assuming complete LD of associated
SNPs with causal variants, the analyzed sample size provided a
70% power to detect a minimum risk of 1.45 for a risk allele
frequency of 45% with a two-sided p = 0.0012 significance level for
the primary outcome (asthma), and ranged from 14.6% to 52.6%
for the analyses in subset of cases with atopic asthma and asthma
before the age at diagnosis cutoff (Table S6). We acknowledge that
risk effects of this range are in the upper bound of those expected
for common variants in complex traits [55], which may have
contributed to our failure to detect associations for some of the
genes tested. Alternatively, our failure to find associations may
possibly be attributed to: i) Our impossibility to test their
association with more relevant traits or patient sub-samples (e.g.
asthma drug responses [56,57], environmental exposures [58]); ii)
The use of controls self-reporting no personal or familiar history of
pulmonary or allergic disease, but without a disease confirmation
based on a clinical characterization (e.g. lung function measure-
ments, SPT or specific IgE testing); iii) The lack of a true
association with asthma susceptibility, as has been suggested for
particularly relevant variants by meta-analyses [56]. Whichever is
correct, a recently published study with on a similar sample size
showed positive and negative association results fully congruent
with ours [59]. In support of our results, we were able to replicate
in silico the association of a SNP in IL4R in the largest GWAS study
Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes
PLOS ONE | www.plosone.org 4 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
published to date that included more than 25,000 Europeans [17].
This SNP from IL4R, as well as few others from the same gene that
were found associated in our study (rs1801275, rs1805015, and
rs3024676), also demonstrated congruent effects and significant
association in a recent GWAS of total IgE levels [60]. This
evidence supports that, despite the enormous efforts to disentangle
asthma genes such as those entailed by the GABRIEL study [17]
or the EVE consortium [19], many more asthma susceptibility
genes awaits its discovery.
Some recent replication studies focusing on candidate genes
have utilized available arrays for genome wide genotyping [61–63]
where common variants of many key asthma candidate genes
could be insufficiently covered. In this respect, Michel et al. [59]
indicated that only 37% of the previously associated SNPs from 14
candidate genes were captured by the array utilized by the same
authors on the first GWAS for asthma and, surprisingly, not a
single SNP from key asthma genes such as ADAM33, IL4 and
CD14 was contained in their array [8]. Only after extending the
study by further genotyping (and by imputation) on the same
samples of their GWAS, these authors were able to consistently
replicate many of the biological candidates that were missing from
their GWAS [59]. We confirmed that the coverage of published
GWAS for asthma performed in European populations to date has
been insufficient for ADAM33 (,30%), even in a best-case scenario
using the HapMap phase 2 data as a reference for comparisons
(Table S7). If array comparisons were made against the 1KGP
sequencing data [38], the coverage would be even lower
(Table S7). Besides, it is worth noting that the estimated coverage
of these genes might be inflated, as these were implicitly derived
for HapMap CEU data and the same data was used to inform the
SNP contents of the array, and we have assumed that the 100% of
SNPs contained in the array were successfully genotyped. Effects
similar to those related to the age-of-onset of asthma, exceptionally
explored [17], could have also contributed to find no association
for the genes explored here in the published GWAS for asthma.
In conclusion, here we found the association of 10 common
variants in three biological candidate genes (MS4A2, IL4R and
ADAM33) that attained study-wise significance, and one of them
was also supported by in silico replication in GWAS data.
Therefore, we provided independent support for their role as risk
factors for the amalgam of asthma phenotypes. Moreover, our
results evidenced the genetic complexity at some of these
susceptibility loci and the importance of considering age-at-onset
effects. Given the low statistical power of the present study,
Figure 1. P-values of association by chromosome position with A) asthma #14years for ADAM33, B) asthma #39 years for MS4A2and, C) asthma #39 years for IL4R. P-values are expressed in –log10 scale. The SNP number shown on the plot denotes the result for themost significant SNP for each gene and the results for the remaining were color coded to reflect their LD with this SNP based on pairwise r2 valuesfrom the 1KGP. Estimated recombination rates (from 1KGP) were also plotted on the right axis to reflect the local LD structure.doi:10.1371/journal.pone.0073157.g001
Table 2. Association summary of the 10 SNPs that resulted significantly associated with asthma after adjustments for the multiplecomparisons.
Gene rs# Positiona ComparisonAllele1/Allele2
Frecuencycontrolsb
Frecuencycasesb OR (95% CI)b p-value
MS4A2 rs569108 59863104 Asthma diagnosed #39 A/G 0.961 0.985 2.45 (1.39–4.33) 2.7E-04c
IL4R rs1805015 27374180 Asthma diagnosed #39 T/C 0.809 0.864 1.45 (1.17–1.80) 2.1E-04c
ADAM33 rs2787093 3648462 Asthma diagnosed #14 T/C 0.890 0.822 0.56 (0.40–0.78) 4.9E-04
rs628965 3649713 Asthma diagnosed #14 G/A 0.619 0.523 0.65 (0.50–0.84) 1.0E-04c
rs628977 3649721 Asthma diagnosed #14 C/T 0.617 0.516 0.66 (0.51–0.85) 3.7E-04c
rs630712 3650066 Asthma diagnosed #14 A/C 0.892 0.826 0.57 (0.41–0.80) 1.0E-04
rs597980 3651165 Asthma diagnosed #14 A/G 0.440 0.326 0.60 (0.46–0.79) 1.2E-04c
rs598418 3651269 Asthma diagnosed #14 A/G 0.618 0.523 0.65 (0.50–0.84) 1.0E-04c
rs2853209 3651472 Asthma diagnosed #14 A/T 0.482 0.362 0.58 (0.45–0.75) 3.8E-05c
rs2787095 3655943 Asthma diagnosed #14 C/G 0.584 0.530 1.51 (1.19–1.91) 3.8E-04c
tSNPs are underlined.aAccording to NCBI build 36.3.bComputed for allele 1.cSNPs associated in previous studies.doi:10.1371/journal.pone.0073157.t002
Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes
PLOS ONE | www.plosone.org 5 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
particularly limited in the case subset analyses when considering
the age at diagnosis, further studies will be needed to identify
causal variants and to unravel if these genes are truly associated
with asthma, with atopy or with both.
Supporting Information
Table S1 Relevant demographic and clinical features ofGOA samples.
(DOC)
Table S2 Information, completion rates and Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) p-values for the tSNPs.(DOC)
Table S3 Association summary of SNPs with asthma,atopic asthma and asthma with age at diagnosis beforethe cutoff demonstrating the largest effects.(DOC)
Table S4 Functional annotation of the 10 associatedSNPs.
(DOC)
Table S5 In silico replication of the associated SNPscontained in the GABRIEL study.(DOC)
Table S6 Sample sizes and statistical power for eachanalysis performed in a subset of cases.
(DOC)
Table S7 Coverage of candidate genes on commercialarrays used in asthma GWAS in samples of Europeanancestry.
(DOC)
Text S1 Supplementary methods.
(DOC)
Acknowledgments
The authors want to thank Tobıas Felipe for programming, and Marıa
Torres (CeGen, Santiago de Compostela Node) for her exceptional
technical support with iPLEXH Gold assays. In addition, we would like to
express our gratitude to the Juvenile Diabetes Research Foundation/
Wellcome Trust Diabetes and Inflammation Laboratory (JDRF/WT DIL,
Cambridge Institute for Medical Research) for granting the access to the
MS4A2 re-sequencing data, and acknowledge that those who carried out
the original analysis and collection of the data bear no responsibility for the
analysis or interpretations of this study.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: MPY CF. Performed the
experiments: MPY AC JC PP ISM ASP JF OAF NB JCGR JV TC.
Analyzed the data: MPY CF. Contributed reagents/materials/analysis
tools: CF MH JV. Wrote the paper: MPY MH CF.
References
1. Ober C (2005) Perspectives on the past decade of asthma genetics. J Allergy Clin
Immunol 116: 274–278.
2. Braman SS (2006) The global burden of asthma. Chest 130: S4–12.
3. Holberg CJ, Halonen M, Wright AL, Martinez FD (1999) Familial aggregation
and segregation analysis of eosinophil levels. Am J Respir Crit Care Med 160:1604–1610.
4. Thomsen SF, van der Sluis S, Kyvik KO, Skytthe A, Backer V (2010) Estimates
of asthma heritability in a large twin sample. Clin Exp Allergy 40: 1054–1061.
5. Ober C, Hoffjan S (2006) Asthma genetics 2006: the long and winding road to
gene discovery. Genes Immun 7: 95–100.
6. Bouzigon E, Forabosco P, Koppelman GH, Cookson WO, Dizier MH, et al.(2010) Meta-analysis of 20 genome-wide linkage studies evidenced new regions
linked to asthma and atopy. Eur J Hum Genet 18: 700–706.
7. Duffy DL, Martin NG, Battistutta D, Hopper JL, Mathews JD (1990) Geneticsof asthma and hay fever in Australian twins. Am Rev Respir Dis 142: 1351–
1358.
8. Moffatt MF, Kabesch M, Liang L, Dixon AL, Strachan D, et al. (2007) Geneticvariants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood
asthma. Nature 448: 470–473.
9. Swarr DT, Hakonarson H (2010) Unraveling the complex genetic underpin-nings of asthma and allergic disorders. Curr Opin Allergy Clin Immunol 10:
434–442.
10. Chanock SJ, Manolio T, Boehnke M, Boerwinkle E, Hunter DJ, et al. (2007)
Replicating genotype-phenotype associations. Nature 447: 655–660.
11. Daley D, Lemire M, Akhabir L, Chan-Yeung M, He JQ, et al. (2009) Analysesof associations with asthma in four asthma population samples from Canada and
Australia. Hum Genet 125: 445–459.
12. Hancock DB, Romieu I, Shi M, Sienra-Monge JJ, Wu H, et al. (2009) Genome-wide association study implicates chromosome 9q21.31 as a susceptibility locus
for asthma in mexican children. PLoS Genet 5: e1000623.
13. Himes BE, Hunninghake GM, Baurley JW, Rafaels NM, Sleiman P, et al. (2009)Genome-wide association analysis identifies PDE4D as an asthma-susceptibility
gene. Am J Hum Genet 84: 581–593.
14. Mathias RA, Grant AV, Rafaels N, Hand T, Gao L, et al. (2010) A genome-wide association study on African-ancestry populations for asthma. J Allergy
Clin Immunol 125: 336–346.
15. Sleiman PM, Flory J, Imielinski M, Bradfield JP, Annaiah K, et al. (2010)
Variants of DENND1B associated with asthma in children. N Engl J Med 362:
36–44.
16. Li X, Howard TD, Zheng SL, Haselkorn T, Peters SP, et al. (2010) Genome-
wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLA-DR/DQ
regions. J Allergy Clin Immunol 125: 328–335.
17. Moffatt MF, Gut IG, Demenais F, Strachan DP, Bouzigon E, et al. (2010) A
large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med 363: 1211–1221.
18. Ferreira MA, McRae AF, Medland SE, Nyholt DR, Gordon SD, et al. (2011)
Association between ORMDL3, IL1RL1 and a deletion on chromosome 17q21
with asthma risk in Australia. Eur J Hum Genet 19: 458–464.
19. Torgerson DG, Ampleford EJ, Chiu GY, Gauderman WJ, Gignoux CR, et al.
(2011) Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically
diverse North American populations. Nat Genet 43: 887–892.
20. Hirota T, Takahashi A, Kubo M, Tsunoda T, Tomita K, et al. (2011) Genome-
wide association study identifies three new susceptibility loci for adult asthma in
the Japanese population. Nat Genet 43: 893–896.
21. Ferreira MA, Matheson MC, Duffy DL, Marks GB, Hui J, et al. (2011)
Identification of IL6R and chromosome 11q13.5 as risk loci for asthma. Lancet
378: 1006–1014.
22. Haldar P, Pavord ID, Shaw DE, Berry MA, Thomas M, et al. (2008) Cluster
analysis and clinical asthma phenotypes. Am J Respir Crit Care Med 178: 218–
224.
23. Henderson J, Granell R, Sterne J (2009) The search for new asthma phenotypes.
Arch Dis Child 94: 333–336.
24. Pino-Yanes M, Sanchez-Machin I, Cumplido J, Figueroa J, Torres-Galvan MJ,
et al. (2012) IL-1 receptor-associated kinase 3 gene (IRAK3) variants associate
with asthma in a replication study in the Spanish population. J Allergy Clin
Immunol 129: 573–575.
25. Halapi E, Gudbjartsson DF, Jonsdottir GM, Bjornsdottir US, Thorleifsson G, et
al. (2010) A sequence variant on 17q21 is associated with age at onset and
severity of asthma. Eur J Hum Genet 18: 902–908.
26. Ahmadi KR, Weale ME, Xue ZY, Soranzo N, Yarnall DP, et al. (2005) A single-
nucleotide polymorphism tagging set for human drug metabolism and transport.
Nat Genet 37: 84–89.
27. Belfer I, Buzas B, Hipp H, Dean M, Evans C, et al. (2004) Haplotype structure
of inflammatory cytokines genes (IL1B, IL6 and TNF/LTA) in US Caucasians
and African Americans. Genes Immun 5: 505–512.
28. Pino-Yanes M, Corrales A, Basaldua S, Hernandez A, Guerra L, et al. (2011)
North African influences and potential bias in case-control association studies in
the Spanish population. PLoS One 6: e18389.
29. Price AL, Patterson NJ, Plenge RM, Weinblatt ME, Shadick NA, et al. (2006)
Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide
association studies. Nat Genet 38: 904–909.
30. R Development Core Team (2008) R: A language and environment for
statistical computing; computing RffS, editor. Viena, Austria.
31. Wigginton JE, Cutler DJ, Abecasis GR (2005) A note on exact tests of Hardy-
Weinberg equilibrium. Am J Hum Genet 76: 887–893.
32. Sun X, Ma SF, Wade MS, Flores C, Pino-Yanes M, et al. (2010) Functional
variants of sphingosine-1-phosphate receptor 1 gene associate with asthma
susceptibility. J Allergy Clin Immunol 126: 241–249.
Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes
PLOS ONE | www.plosone.org 6 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
33. Chakraborty R, Zhong Y (1994) Statistical power of an exact test of Hardy-
Weinberg proportions of genotypic data at a multiallelic locus. Hum Hered 44:1–9.
34. Salanti G, Amountza G, Ntzani EE, Ioannidis JP (2005) Hardy-Weinberg
equilibrium in genetic association studies: an empirical evaluation of reporting,deviations, and power. Eur J Hum Genet 13: 840–848.
35. Balding DJ (2006) A tutorial on statistical methods for population associationstudies. Nat Rev Genet 7: 781–791.
36. Gonzalez JR, Armengol L, Sole X, Guino E, Mercader JM, et al. (2007)
SNPassoc: an R package to perform whole genome association studies.Bioinformatics 23: 644–645.
37. Li Y, Willer CJ, Ding J, Scheet P, Abecasis GR (2010) MaCH: using sequenceand genotype data to estimate haplotypes and unobserved genotypes. Genet
Epidemiol 34: 816–834.38. The 1000 Genomes Project Consortium (2010) A map of human genome
variation from population-scale sequencing. Nature 467: 1061–1073.
39. Macgregor S, Craddock N, Holmans PA (2006) Use of phenotypic covariates inassociation analysis by sequential addition of cases. Eur J Hum Genet 14: 529–
534.40. Pruim RJ, Welch RP, Sanna S, Teslovich TM, Chines PS, et al. (2010)
LocusZoom: regional visualization of genome-wide association scan results.
Bioinformatics 26: 2336–2337.41. Storey JD, Tibshirani R (2003) Statistical significance for genomewide studies.
Proc Natl Acad Sci USA 100: 9440–9445.42. Ward LD, Kellis M (2012) HaploReg: a resource for exploring chromatin states,
conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linkedvariants. Nucleic Acids Res 40: D930–934.
43. Vercelli D (2008) Discovering susceptibility genes for asthma and allergy. Nat
Rev Immunol 8: 169–182.44. Gelfand EW (2008) Is asthma in childhood different from asthma in adults? Why
do we need special approaches to asthma in children? Allergy Asthma Proc 29:99–102.
45. Lasky-Su J, Lyon HN, Emilsson V, Heid IM, Molony C, et al. (2008) On the
replication of genetic associations: timing can be everything! Am J Hum Genet82: 849–858.
46. Bouzigon E, Corda E, Aschard H, Dizier MH, Boland A, et al. (2008) Effect of17q21 variants and smoking exposure in early-onset asthma. N Engl J Med 359:
1985–1994.47. Castro-Giner F, de Cid R, Gonzalez JR, Jarvis D, Heinrich J, et al. (2010)
Positionally cloned genes and age-specific effects in asthma and atopy: an
international population-based cohort study (ECRHS). Thorax 65: 124–131.48. Barbee RA, Kaltenborn W, Lebowitz MD, Burrows B (1987) Longitudinal
changes in allergen skin test reactivity in a community population sample.J Allergy Clin Immunol 79: 16–24.
49. Boulet LP, Turcotte H, Laprise C, Lavertu C, Bedard PM, et al. (1997)
Comparative degree and type of sensitization to common indoor and outdoor
allergens in subjects with allergic rhinitis and/or asthma. Clin Exp Allergy 27:
52–59.
50. Nicolae DL, Ober C (2009) (Too) great expectations: the challenges in
replicating asthma disease genes. Am J Respir Crit Care Med 179: 1078–1079.
51. Pulit SL, Voight BF, de Bakker PI (2010) Multiethnic genetic association studies
improve power for locus discovery. PLoS One 5: e12600.
52. Manolio TA, Collins FS, Cox NJ, Goldstein DB, Hindorff LA, et al. (2009)
Finding the missing heritability of complex diseases. Nature 461: 747–753.
53. Baye TM, Butsch Kovacic M, Biagini Myers JM, Martin LJ, Lindsey M, et al.
(2011) Differences in candidate gene association between European ancestry and
African American asthmatic children. PLoS One 6: e16522.
54. Botigue LR, Henn BM, Gravel S, Maples BK, Gignoux CR, et al. (2013) Gene
flow from North Africa contributes to differential human genetic diversity in
southern Europe. Proc Natl Acad Sci USA, in press.
55. Hindorff LA, Sethupathy P, Junkins HA, Ramos EM, Mehta JP, et al. (2009)
Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci
for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci USA 106: 9362–9367.
56. Contopoulos-Ioannidis DG, Manoli EN, Ioannidis JP (2005) Meta-analysis of
the association of beta2-adrenergic receptor polymorphisms with asthma
phenotypes. J Allergy Clin Immunol 115: 963–972.
57. Finkelstein Y, Bournissen FG, Hutson JR, Shannon M (2009) Polymorphism of
the ADRB2 gene and response to inhaled beta-agonists in children with asthma:
a meta-analysis. J Asthma 46: 900–905.
58. Simpson A, John SL, Jury F, Niven R, Woodcock A, et al. (2006) Endotoxin
exposure, CD14, and allergic disease: an interaction between genes and the
environment. Am J Respir Crit Care Med 174: 386–392.
59. Michel S, Liang L, Depner M, Klopp N, Ruether A, et al. (2010) Unifying
candidate gene and GWAS Approaches in Asthma. PLoS One 5: e13894.
60. Granada M, Wilk JB, Tuzova M, Strachan DP, Weidinger S, et al. (2012) A
genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the
Framingham Heart Study. J Allergy Clin Immunol 129: 840–845.
61. Galanter JM, Torgerson D, Gignoux CR, Sen S, Roth LA, et al. (2011)
Cosmopolitan and ethnic-specific replication of genetic risk factors for asthma in
2 Latino populations. J Allergy Clin Immunol 128: 37–43.
62. Rogers AJ, Raby BA, Lasky-Su JA, Murphy A, Lazarus R, et al. (2009) Assessing
the reproducibility of asthma candidate gene associations, using genome-wide
data. Am J Respir Crit Care Med 179: 1084–1090.
63. Wu H, Romieu I, Shi M, Hancock DB, Li H, et al. (2010) Evaluation of
candidate genes in a genome-wide association study of childhood asthma in
Mexicans. J Allergy Clin Immunol 125: 321–327.
Age at Diagnosis Effects in Asthma Candidate Genes
PLOS ONE | www.plosone.org 7 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73157
Letter to the Editor
HLA-DRB1*15:01 allele protects from asthmasusceptibility
To the Editor:
Asthma is a chronic inflammatory disease associated withgenetic and environmental factors. The HLA locus is the mostpolymorphic and gene-dense region of the human genome andhas been associated with a large number of infectious andautoimmune diseases.1 Before the advent of genome-wideassociation studies (GWAS), HLA-DRB1 and HLA-DQB1 geneswere independently associated with asthma and related traits inseveral candidate gene association studies.2 The importance ofthese genes in the pathogenesis of asthma has recently beencorroborated by both individual and meta-analyzed GWAS.3-5
In spite of the evidence, the interpretation of these associationscan be problematic because of the complex relationship betweenthe allele at single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and thevariation at classical HLA alleles. Interestingly, classic allelesassociatewith stronger effects than individual SNPs and constitutethe most likely functional variants.6 Here, we aimed to test theassociation of SNPs from HLA-DRB1 and HLA-DQB1 withasthma in Spanish samples, and to uncover the classic allelesthat are involved in the susceptibility to the disease.
In the discovery stage, DNA samples from 574 physician-diagnosed asthmatic patients from the Genetics of Asthma (GOA)study in the Spanish population were compared with samples of1186 nonasthmatic subjects obtained from the Spanish NationalDNA Biobank (www.bancoadn.org).7 An independent sample of568 asthma cases and 787 controls was used for replication. Forfurther description of the study design, see Fig E1, OnlineRepository text, and Table E1 in this article’s Online Repositoryat www.jacionline.org.
A total of 22 SNPs capable of predicting classic alleles fromHLA-DRB1 and HLA-DQB1 in European populations weregenotyped in the discovery sample using a combination ofdifferent methods (see Table E2 in this article’s Online Repositoryat www.jacionline.org).8 Their performance on predictingHLA-DRB1 and HLA-DQB1 classic alleles was first assessed bygenotyping 313 DNA samples from healthy Spanish individualswith paired data for classic alleles at a 4-digit resolution(Luminex, Austin, Tex). To impute classic alleles, we used areference data set with more than 2500 samples of Europeanancestry with dense SNP data and classical HLA allele typing.6
We used a new probabilistic approach (HLP*IMP:02), whichdelivers increased accuracy on European samples, even underconditions of reduced SNP coverage.6 The imputed alleles forthe training sample were compared with the observed classicalleles at 2-digit and 4-digit resolution. Only those classic allelesthat attained 80% or more sensitivity, specificity, and positive andnegative predictive values and that were common in the trainingsample (frequency >_5%) were tested for association.
The association of SNPs with asthma in the discovery samplewas tested using logistic regression models and includedpreviously obtained ancestry scores as covariates to adjust forpopulation stratification.7 In this stage, we performed multipletesting adjustments for SNPs and classic alleles by means of105 permutations in which case-control labels were swappedwhile maintaining the haplotype structure.
Seventeen SNPs were successfully genotyped and passedquality control checks (see Online Repository text andTable E2). Four of them were associated with asthma inthe discovery sample after multiple comparison adjustments(1.24 <_ odds ratio [OR] <_ 1.94, 2.8 3 1027 <_ P <_ .002)(see Table E3 and Fig E2 in this article’s Online Repository atwww.jacionline.org) and 2 of them were nominally significantin replication samples (P <_ .008) (Table I). A meta-analysisconfirmed the consistency of the effects for the association ofrs3135388 and rs6457617 with asthma (P 5 7.8 3 1025 and3.0 3 1025, respectively) (Table I), and conditionalregression analysis in the overall sample revealed theirindependent association (P 5 1.3 3 1024 for rs3135388 andP 5 1.5 3 1024 for rs6457617), consistent with their weaklinkage disequilibrium (r2 5 0.06).
In silico analysis of expression quantitative trait loci (eQTLs)revealed the role of associated SNPs as eQTLs for HLA-DRB1and/or HLA-DRB5 in lymphoblastoid cells derived fromEuropean individuals (see Table E4 in this article’s OnlineRepository at www.jacionline.org). The SNP rs3135388 wasalso located on an enhancer histone mark site in B-lymphocytecells and a transcription factor binding site as demonstrated byempirical data from the Encyclopedia of DNA Elements(ENCODE) (http://www.genome.gov). In addition, our resultsfor rs6457617 constitute a replication of a GWAS hit for asthmain Japanese.3 Interestingly, the 2 associated SNPs showedconsistent effects with those reported for lipid traits (see TableE5 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org).
Quality assessment of the imputation of the 76 classic allelesdetected in the training sample (see Table E6 in this article’sOnline Repository at www.jacionline.org) revealed that 14 ofthe 25 common alleles passed our quality criteria and werefollowed-up for association analysis using logistic regressionmodels. Three classic alleles were associated with asthma in thediscovery sample after multiple testing adjustments (see TableE7 in this article’s Online Repository at www.jacionline.org):HLA-DQB1*06, HLA-DRB1*15, and HLA-DRB1*15:01(.001 <_ P <_ 1.0 3 1025). However, only 2 of them replicated atnominal significance: HLA-DRB1*15 and HLA-DRB1*15:01(P 5 .001 and .008, respectively). A meta-analysis confirmeda consistent protective effect of HLA-DRB1*15:01 forasthma across all the samples (OR, 0.66; 95% CI, 0.53-0.81;P5 6.73 1025). Interestingly,HLA-DRB1*15:01 has previouslybeen associated with an increased risk for multiple sclerosis andnarcolepsy. This result is consistent with other susceptibilitygenes that have been shown to have opposite effects in asthmaand autoimmune diseases (Table E5).9,10 However, this study isthe first revealing such an effect for a classic HLA allele.
Because a previous study has found an association betweenSNPs from the HLA region and sensitization to specificallergens,11 we performed a post hoc analysis for sensitizationto the 3 most common specific allergens within the asthmacases (see Online Repository text), and identified SNPrs2395175 as associated with the presence of sensitization todust mites, pollens, and animal epithelia in the discoverysample (P <_ .004), with both harmful and protective associations,depending on the allergen (see Table E8 in this article’sOnline Repository at www.jacionline.org). However, only the
1
TABLE I. Summary of association testing of HLA-DQB1 and HLA-DRB1 SNPs and classic alleles with asthma susceptibility
rs#/gene Effect allele
Discovery sample (n 5 1760)
Replication sample
(n 5 1355) Meta-analysis (n 5 3115)
OR (95% CI) P value OR (95% CI) P value
Q test
P value* OR (95% CI)
FE
P value
RE
P value
rs2395175 A 1.94 (1.51-2.49) 2.8 3 1027� 0.99 (0.72-1.35) .931 .001 1.39 (0.72-2.70)� 6.6 3 1025 4.5 3 1026
rs3135388 A 0.66 (0.50-0.87) .002� 0.63 (0.41-0.97) .008� .976 0.66 (0.54-0.81)§ 7.8 3 1025� 9.4 3 1025
rs6457617 T 1.25 (1.08-1.44) .003� 1.26 (1.07-1.48) .005� .947 1.25 (1.13-1.39)§ 3.0 3 1025� 3.6 3 1025
rs7764856 A 1.24 (1.07-1.45) .005� 1.00 (0.84-1.19) .973 .063 1.13 (1.01-1.27)§ .029 .028
HLA-DQB1 *06 0.67 (0.56-0.80) 1.0 3 1025� 0.97 (0.91-1.02) .249k 1.3 3 1024 0.81 (0.57-1.16)� 4.5 3 1023 1.2 3 1024
HLA-DRB1 *15 0.64 (0.49-0.84) .001� 0.87 (0.80-0.95) .001�k .026 0.77 (0.57-1.03)� 1.2 3 1024 1.3 3 1024�HLA-DRB1 *15:01 0.65 (0.49-0.86) .002� 0.66 (0.49-0.90) .008� .918 0.66 (0.53-0.81)§ 6.7 3 1025� 8.0 3 1025
FE, Fixed-effects; RE, random-effects.
*Cochran’s Q test for heterogeneity.
�Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.
�Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.
§Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.
kClassical allele data were available only for a subset of 785 samples.
TABLE II. Summary of association testing of the SNP rs2395175 with allergic sensitization against dust mites, pollens, and animal
epithelia
Allergen
Discovery sample Replication sample Meta-analysis
Sample
size* OR (95% CI) P value
Sample
size* OR (95% CI) P value
Sample
size*
Q test
P valuey OR (95% CI)
FE
P value
RE
P value
Dust mites 253:173 2.69 (1.58-4.59) 2.7 3 1024� 437:110 1.18 (0.64-2.20) .597 690:283 .048 1.81 (0.81-4.06)§ .002 .002
Pollens 163:262 0.46 (0.27-0.79) .004� 224:344 1.06 (0.64-1.76) .830 387:606 .029 0.70 (0.31-1.57)§ .069 .042
Animal
epithelia
128:282 2.07 (1.28-3.35) .003� 219:349 1.94 (1.20-3.12) .007� 347:631 .842 2.00 (1.43-2.81)k 5.6 3 1025� 6.7 3 1025�
FE, Fixed-effects; RE, random-effects.
*Number of individuals with positive and negative sensitization (sensitized: nonsensitized).
�Cochran’s Q test for heterogeneity.
�Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.
§Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.
kEffect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
nnn 2014
2 LETTER TO THE EDITOR
association with animal epithelia sensitization was replicated inindependent samples (P <_ .003), showing a large effectsize in the meta-analysis (OR, 2.00; 95% CI; 1.43-2.81; P 5 5.63 1025) (Table II). This SNP was also an eQTL for HLA-DRB1and/or HLA-DRB5 in lymphoblastoid cells (Table E4).
Our study has 2 main limitations. First, it had more than 80%statistical power for variants with an OR of more than 1.3, but notfor smaller effect sizes (see Fig E3 in this article’s OnlineRepository at www.jacionline.org). Second, association testingof the full spectrum of classic alleles at these 2 genes wasimpracticable, both because of sample size limitations andbecause of the imperfect predictive ability of the SNPs retainedfor classic allele imputation. Consequently, we analyzed only56% of common classic alleles in this population (see OnlineRepository text). It is possible that we missed other interestingassociations, as suggested by the fact that a weighted scoreincluding the 2 SNPs associated with asthma explained slightlyhigher phenotypic variance than did a model including the classicalleles (Nagelkerke’s R2 5 0.14 vs 0.10, respectively).
In summary, a deeper examination of HLA genes has revealed aclassic allele that shows pleiotropic effects for asthma and otherimmune-related diseases and likely constitutes a putative causalvariant. Analysis of SNPs also revealed shared genetic risk factorsbetween asthma and lipid levels. Finally, we provided evidencesupporting the role of HLA polymorphisms in specific allergicsensitization.
We thank Alexander Dilthey, Goncalo Abecasis, and Christian Fuchsberger
for their help with software tools, Servicio de Apoyo Inform�atico a la
Investigaci�on (ULL) for the HPC support, and Katherine K. Nishimura for
proofreading the manuscript.
Mar�ıa Pino-Yanes, PhDa,b,c
Almudena Corrales, CLTa,b
Marialbert Acosta-Herrera, MSca,b,d
Eva P�erez-Rodr�ıguez, MDe
Jos�e Cumplido, MDf
Paloma Campo, MD, PhDg
Amalia Barreto-Luis, BSa,b
Florentino S�anchez-Garc�ıa, MD, PhDh
Tob�ıas Felipe, PhDi
Inmaculada S�anchez-Mach�ın, MDj
In�es Quintela, MSck
Jos�e Carlos Garc�ıa-Robaina, MDe
Jes�us Villar, MD, PhDa,d
Miguel Blanca, MD, PhDg
Angel Carracedo, MD, PhDl,m
Teresa Carrillo, MDf
Carlos Flores, PhDa,b,n
From aCIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid,
Spain; bResearch Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria, Tenerife, Spain;cthe Department of Medicine, University of California, San Francisco, Calif; dthe
Research Unit, Multidisciplinary Organ Dysfunction Evaluation Research Network
(MODERN), Hospital Universitario Dr Negrin, Gran Canaria, Spain; ethe Allergy
Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria, Tenerife, Spain; fAllergy Unit,
Hospital Universitario Dr Negr�ın, Gran Canaria, Spain; gAllergy Service, Carlos
J ALLERGY CLIN IMMUNOL
VOLUME nnn, NUMBER nn
LETTER TO THE EDITOR 3
Haya Hospital, Malaga, Spain; hthe Immunology Unit, Hospital de Gran Canaria
Dr Negr�ın, Gran Canaria, Spain; iNorthWest Research Associates, Boulder, Colo;jthe Allergy Unit, Hospital del T�orax, Complejo Hospitalario Universitario NS
Candelaria, Tenerife, Spain; kGrupo de Medicina Xen�omica, CEGEN-ISCIII-
Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain; lGrupo
de Medicina Xen�omica, Fundaci�on Galega de Medicina Xen�omica (SERGAS)-
CIBERER-Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain;mCenter of Excellence in Genomic Medicine Research, King Abdulaziz University,
Jeddah, Saudi Arabia; and nApplied Genomics Group (G2A), Genetics Laboratory,
Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud P�ublica de Canarias,
Universidad de La Laguna, Tenerife, Spain. E-mail: cflores@ull.edu.es.
This work was supported by grants from the Health Institute ‘‘Carlos III’’ (grant no. FIS
PI08/1383 and grant no. FIS PI11/00623) and cofinanced by the European Regional
Development Funds, ‘‘Away of making Europe’’ from the European Union, and by a
specific agreement between Instituto de Salud Carlos III and Gobierno de Canarias
(grant no. EMER07/001). M. Pino-Yanes was supported by a postdoctoral fellowship
from Fundaci�on Ram�on Areces. M. Acosta-Herrera and A. Barreto-Luis were sup-
ported by fellowships from the Instituto de Salud Carlos III (grant no. FI11/00074
and grant no. FI12/00493, respectively).
Disclosure of potential conflict of interest: M. Pino-Yanes has received funding from the
Fundaci�on Ram�on Areces. A. Carracedo is employed at the University of Santiago,
which has received funding from the Ministry of Justice, the Ministry of Health,
and the European Union. The rest of the authors declare that they have no relevant
conflicts of interest.
REFERENCES
1. Gregersen PK, Behrens TW. Genetics of autoimmune diseases–disorders of
immune homeostasis. Nat Rev Genet 2006;7:917-28.
2. Ober C, Hoffjan S. Asthma genetics 2006: the long and winding road to gene
discovery. Genes Immun 2006;7:95-100.
3. Hirota T, Takahashi A, Kubo M, Tsunoda T, Tomita K, Doi S, et al. Genome-wide
association study identifies three new susceptibility loci for adult asthma in the
Japanese population. Nat Genet 2011;43:893-6.
4. Li X, Howard TD, Zheng SL, Haselkorn T, Peters SP, Meyers DA, et al.
Genome-wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLA-DR/
DQ regions. J Allergy Clin Immunol 2010;125:328-35.e11.
5. Moffatt MF, Gut IG, Demenais F, Strachan DP, Bouzigon E, Heath S, et al. A
large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. N Engl
J Med 2010;363:1211-21.
6. Dilthey A, Leslie S, Moutsianas L, Shen J, Cox C, Nelson MR, et al.
Multi-population classical HLA type imputation. PLoS Comput Biol 2013;9:
e1002877.
7. Pino-Yanes M, Sanchez-Machin I, Cumplido J, Figueroa J, Torres-Galvan MJ,
Gonzalez R, et al. IL-1 receptor-associated kinase 3 gene (IRAK3) variants
associate with asthma in a replication study in the Spanish population. J Allergy
Clin Immunol 2012;129:573-5.e10.
8. Leslie S, Donnelly P, McVean G. A statistical method for predicting classical HLA
alleles from SNP data. Am J Hum Genet 2008;82:48-56.
9. Li X, Ampleford EJ, Howard TD, Moore WC, Torgerson DG, Li H, et al.
Genome-wide association studies of asthma indicate opposite immunopatho-
genesis direction from autoimmune diseases. J Allergy Clin Immunol 2012;130:
861-8.e7.
10. Noguchi E, Sakamoto H, Hirota T, Ochiai K, Imoto Y, Sakashita M, et al.
Genome-wide association study identifies HLA-DP as a susceptibility gene for
pediatric asthma in Asian populations. PLoS Genet 2011;7:e1002170.
11. Hinds DA, McMahon G, Kiefer AK, Do CB, Eriksson N, Evans DM, et al.
A genome-wide association meta-analysis of self-reported allergy identifies shared
and allergy-specific susceptibility loci. Nat Genet 2013;45:907-11.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jaci.2014.05.031