Post on 20-Aug-2020
Agarose Gel Electrophoresis
الكهربائي( الفصل)هالم الرحالن
• Gel electrophoresis is a widely used technique
for the analysis of nucleic acids and proteins.
Agarose gel electrophoresis is routinely used
for the preparation and analysis of DNA
هالم الرحالن الكهربائي هو أحد التقنيات واسعة اإلستخدام لتحليل •
األحماض النووية والبروتين
تستخدم هذه التقنية بشكل روتيني لتحضير وتحليل الدنا•
• Gel electrophoresis is a procedure that
separates molecules on the basis of their rate
of movement through a gel under the influence
of an electrical field
هذه التقنية هي عملية لفصل الجزيئات على قاعدة معدل تحركها عبر •
الجل تحت تأثير الحقل الكهربائي
• We will be using agarose gel electrophoresis
to determine the presence and size of PCR
products. PCR products indicate the
presence of DNA
يستخدم هالم الرحالن الكهربائي لتحديد وجود وحجم منتج •
، حيث أن وجود منتج البلمرة (PCR)اإلسترداد أو البلمرة
أواإلسترداد يعني وجود الدنا
• DNA is negatively charged
يحمل الدنا شحنات كهربائية سالبة
+ -
Power الطاقة
DNA
• When placed in an electrical field, DNA will migrate toward the positive pole (anode)
(األنود)عندما يوضع في حقل كهربائي، فإن الدنا يهاجر نحو القطب الموجب
H
O2
Scanning Electron Micrograph
of Agarose Gel (1×1 µm)
• Polymerized agarose is porous,
allowing for the movement of DNA
يسمح مبلمر األقروز غير المسامي بحركة الدنا
+ -
Power
DNA
How fast will the DNA migrate?
بأي سرعة يهاجر الدنا؟
Size of the DNA! حجم الدنا
*Small DNA move faster than large DNA
النا الصغير يتحرك أسرع من الدنا الكبير…gel electrophoresis separates DNA according to size
هالم الرحالن يفصل الدنا بحسب حجمها
small large
Within an agarose gel, linear DNA migrate inversely proportional to the log10 of their molecular weight
في الهالم يتحرك الدنا الخطي بمعدل عكسي الى لوغريثم وزنها الجزيئ
Agarose
Agarose is a linear polymer extracted from seaweed
األقاروز عبارة عن مبلمر خطي مستخرج من األعشاب البحرية
D-galactose 3,6-anhydro L-galactose
•Agarose was first used in biology when Robert Koch* used it as a culture medium for Tuberculosis bacteria in 1882
أستخدم األقاروز في األحياء الول مرة •
بواسطة روبرت كوخ كوسط مزرعي لبلكتريا 1882الدرن سنة
Making an Agarose Gel كيفية عمل هالم األقاروز
An agarose gel is prepared by combining agarose powder and a buffer solution
يحضر األقروز بخلط مسحوق القروز بمحلول البفر
Agarose
األقروز
Buffer
البفر
Flask for boiling
قارورة للغلي
Casting tray
صينية صبGel combs
Power supply
مصدر للطاقة
Gel tank
وعاء الهالم
Cover
غطاء
Electrical leads
وصالت كهربائية
Electrophoresis Equipment معدات الرحالن الكهربائي
Gel combs
أمشاط الهالم
Gel casting tray & combs
صينية الصب واألمشاط
Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray
يجب اال يلتصق أي . إلزق حواف صينية الصب ثم ضع األمشاط، ضع صينية الصب على سطح مستوي
من أمشاط الهالم سطح صينية الصب
Preparing the Casting Tray
تحضير صينية الصب
Agarose
األقروزBuffer Solution
محلول البفر
Combine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer
إستخدم قارورة يكون حجمها أكبر من حجم البفر‘ إمزج مسحوق األقروز بمحلول البفر
Agarose is insoluble at room temperature (left) (لليسار)األقروز غير قابل للذوبان في درجة حرارة الغرفة
The agarose solution is boiled until clear (right) (لليمين)عند غلي محلول األقروز يصبح نقيا
Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve
لضمان تذويب كل حبوب األقروز، يجب تحريك المحلول على فترات عند التسخين ***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven
يجب الحذر عند غلي القروز حيث أن التسخين الزائد قد يؤدي لغليان األقروز بعنف
Melting the Agarose
تذويب األقروز
Allow the agarose solution to cool slightly (~60ºC) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Avoid air bubbles
ومن ثم صب األقروز الذائب في الصينية، تفادي ( درجة مئوية 60)أترك األقروز ليبرد قليال
فقاعات الهواء
Pouring the gel (الجل)صب الهالم
Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution
يجب أن تكون أمشاط الهالم مغمورة في محلول األقروز الذائب
When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape
عندما تبرد مبلمرات األقروز فإنها تكون هالم مرن، ويجب أن يظهر بلون فاتح عندما تبرد تماما ، أزل األمشاط والشريط بحذر(درجة مئوية 30-45)
Place the gel in the electrophoresis chamber
ضع الهالم في غرفة الرحالن
buffer
البفر
Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.
مم، تأكد من أن كل الفتحات مليئة بالبفر 1أضف مقدار كاف من البفر ليغطي الهالم لعمق
Cathode
القطب السالب(negative )
Anode
القطب المجب(positive)
Wells
فتحات
DNA
الدنا
6X Loading Buffer:
البفر Bromophenol Blue (for color)
(للون)البروموفينول األزرق Glycerol (for weight)
(للوزن)الجليسرول
Sample Preparation
تحضير العينةMix the samples of DNA with the 6X sample loading buffer (w/ tracking dye). This allows the samples to be seen when loading onto the gel, and increases the density of the samples, causing them to sink into the gel wells
أحجام من البفر الممزوجة بصبغة تتبع تسمح برؤية العينات في الهالم إضافة 6أمزج عينة الدنا مع الى زيادة كثافة العينات وجعلها تغرق في فتحات الهالم
Loading the Gel تحميل الهالم
Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip
يجب إغراق العينة في الفتحة، يجب الحذر لعدم . ضع طرف الماصة فوق الفتحة وبرفق فرغ العينة
ثقب الهالم بطرف الماصة
Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber
يبدأ الدنا في . ضع الغطاء على غرفة الرحالن، صل الوصالت الكهربائية، صل الوصالت مع مصدر التيار عند إيصال التيار فتتكون فقاعات في األقطاب في غرفة الرحالن(. األحمر)الهجرة تجاه األنود
Running the Gel تشغيل الهالم
Wells
الفتحات Bromophenol Blue
البروموفينول األزرق
Cathode
الكاثود(-)
Anode
األنود(+)
After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in the same direction as the DNA
بعد تمرير التيار، تأكد من أن الهالم يجري في اإلتجاه الصحيح، يجري البروموفينول األزرق في نفس إتجاه الدنا
DNA (-)
100 200 300
1,650
1,000
500
850
650
400
12,000 bp
5,000
2,000
Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs
في الهالم يجعل تحديد حجم الدنا المجهول سهال ( دنا معروف الحجم)إضافة الدر الدنا
+
bromophenol blue
Note: bromophenol blue migrates at approximately the same rate as a 300 bp DNA molecule
يالحظ أن البروموفينول األزرق
300يجري بمعدل يساوي
بيزبير من حجم الدنا
DNA Migration
هجرة الدنا
DNA Ladder Standard
الدر الدنا القياسي
Staining the Gel تصبيغ الهالم
• Ethidium bromide binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel
يرتبط بروميد اإليثيديوم مع الدنا ويتفلور تحت األشعة فوق البنفسجية وبالتالي يسمح برؤية الدنا في الهالم
• Ethidium bromide can be added to the gel and/or running buffer before the gel is run or the gel can be stained after it has run
أو البفر قبل جريان الهالم أو يمكن تصبيغ الهالم بعد /يمكن إضافة بروميد اإليثديوم الى الهالم و الجريان
***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times
يجب لبس القفازات . يعتبر بروميد اإليثيديوم مادة مسرطنة قوية ومتوسط السمية: تحذير على الدوام
Safer alternatives to Ethidium Bromide
من البدائل اآلمنة لبروميد اإليثيديوم Methylene Blue
الميثلين األزرق
Bio-Safe DNA Stain
صبغة الدنا اآلمنة
Ward’s - QUIKView DNA Stain
كويك فيو-صبغة وارد
Carolina BLU Stain
صبغة كارولينا الزرقاء
Advantages
المزاياInexpensive
رخيصةLess toxic
أقل سميةNo UV light required
ال تحتاج لألشعة فوق البنفسجيةNo hazardous waste disposal
ال توجد مخاطر منها كنفايات
Disadvantages
العيوبLess sensitive
أقل حساسية More DNA needed on gel
تتطلب المزيد من الدنا في الهالم Longer staining/destaining time
تحتاج لوقت أطول للتصبيغ وإزالة الصبغة
Staining the Gel تصبيغ الهالم
• Place the gel in the staining tray containing warm diluted stain
ضع الهالم في صينية الصبغة التي تحتوي على الصبغة الدافئة المخففة • Allow the gel to stain for 25-30 minutes
دقيقة 30-25دع الهالم ليصتبغ لحوالي • To remove excess stain, allow the gel to destain in water
ألزالة الصبغة الزائدة، ضع الهالم في الماء • Replace water several times for efficient destain
لإلزالة التامة للصبغة الزائدة إستبدل الماء عدة مرات
Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize
يحتاج بروميد اإليثيديوم الى مصدرلألشعة فوق البنفسجية للرؤية
Visualizing the DNA (ethidium bromide)
(بروميد اإليثيديوم)تصور الدنا
100 200 300
1,650 1,000
500
850 650
400
5,000 bp 2,000
DNA ladder
الدر الدنا
DNA ladder
الدر الدنا
PCR Product
منتج اإلسترداد
1 2 3 4 5 6 7 8 Wells
الفتحات
+ - - + - + + - Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for DNA
(1،4،6،7)العينات الموجبة للدنا
Visualizing the DNA (QuikVIEW stain)
(صبغة كويك فيو)تصور الدنا
DNA ladder
الدر الدنا
PCR
Product
منتج اإلستردا
Wells
الفتحات
Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for DNA
(1،6،7،10،12)العينات الموجبة
1,000
500
2,000 bp