Post on 27-Dec-2015
description
Virología Ambiental
María Eugenia Galeano Dinatale, M.Sc.Universidad Nacional de Asunción
Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud
Dpto. de Biología Molecular y Genética
e-mail: maruphd@hotmail.com
Universidad Nacional de Asunción
Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud
IICS - UNA
Mimivirus Parvovirus
18 nm
Bacteriofago
Influenza virus
Diferente Estructura / Propiedades de superficie
Envueltos (Hidrofóbico)- No envueltos (Hidrofílico) Genoma: RNA ó DNA
Recordemos.....Virus. Características generales:
DNA
Diferentes
Tamaños/Formas
• Son tan pequeños por lo que pueden actuar como partículas coloidales
en el ambiente, pueden interactuar con vários medios y matrices (ej:
aire, agua, desechos, superficies).
Submicroscópicos
Parásitos intercelulares obligados
Biológicamente activos sólo en el huésped
(animal, humano, vegetal o bacteriano)
• Vários procesos de
transporte, dilución, secuestro, degradación e
inactivación...
Ambiente
• Directa
• Indirecta
• Vector
• Vehículos
TransmisiónRespiratoria
Fecal - Oral
Gotas
(dia >20 μm)
Aerosoles
(dia <5 μm)
Agua Alimentos Fomites/Superfícies
*Bacterias: Campylobacter spp, Clostridium perfringens, Salmonella spp.,
Shigella spp., Staphylococcus spp. Escherichia coli.
*Protozoarios: Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Toxoplasma gondii.
*Virus: Norovirus, Hepatitis A, Rotavirus, Hepatitis E.
Modificado de: Mead et al. 1999. Emerg Infect Dis. 5(5):607-25.
CONTAMINACIÓN MICRIOBIOLÓGICA DE
LOS ALIMENTOS y AGUAS DE CONSUMO
13%7%
80%
BACTERIAS
PROTOZOARIOS
VIRUS
Virología Ambiental
Aspecto aplicado de la Virología.
• Estudia a los virus en ambientes acuáticos, suelo,
alimentos, superfícies o aerosoles.
Virus: ¿Cuales?
• Virus entéricos ó de transmisión fecal-oral
• Virus respiratorios
• Virus de importancia agroganadera
-Parámetros de calidad de agua/alimentos: Coliformes
Fecales y Totales. E coli
-Facilidad de transporte y persistencia en el ambiente.
- Potencial / Riesgo de transmisión.
- Importancia clínica: capacidad de exposición del
hospedador, de infectar y causar enfermedad.
• Físicos
• Químicos
• Biológicos
• Ecológicos
Factores que afectan a los virus en el
ambienteHumedad Relativa (HR).
Temperatura.
Luz Solar / UV.
Secuestro ó retención.
Químicos antivirales específicos. ej: Amonio.
Niveles de pH (>8,5).
Asociación con sólidos. ej: biopelículas, flóculos.
Material orgánico: tipo y volúmen.
Composición del medio de suspensión.
Calidad del aire. Polución.
Tipo de virus. ej: envuelto / no-envuelto.
Propiedades de la superfície del vírus.
Formación de bioaerosoles
Antagonismo microbiológico
Condiciones climáticas. ej: Lluvia.
Actividad del medio. ej. flujo, caudal, etc.
Ciclo de transmisión del virus.
Comportamiento Humano
Degradación del ambiente
• Objetivo principal y Tipo de medio
• Características del medio vs. Concentración viral
• Concentración viral vs. Volumen de muestra
• Volumen de muestra vs. Maniobrabilidad y
Factibilidad costo/espacio/tiempo
Sistemas de Recuperación, Detección y
Cuantificación de partículas virales
• En heces, vísceras de animales, desechos
tratados, alimentos y muestras ambientales con alta
concentración de virus. Extracción simple con solventes y
elución. Microscopia electrónica y cultivo celular. (Deng and
Cliver, 1992; Turner et al., 1999)
• En muchos medios los virus se encuentran tan diluidos que
necesitan ser concentrados, separados y purficados de los
constituyentes del medio que puedan interferir con su
detección. (Bosch, 1998) Cultivo celular y métodos
moleculares.
• Vírus entéricos más frecuentes:
Rotavirus Astrovirus Adenovirus 40/41
Calicivirus HepatitisA Hepatitis E
Enterovirus Poliovirus Bocavirus
Aichivirus Coxsackie virus Echovirus
Reovirus Torqueteno virus
• Método de concentración IDEAL: técnicamente simple, rápido y
accesible, capaz de procesar grandes volúmenes de água, de
obtener volumen pequeño de concentrado, de promover una gran
recuperación y de detectar una ámplia variedad de virus, además
de ser repetitivo y reproducible (Bosch, 1998; Li et al., 1998; Wyn-
Jones & Sellwood, 2001).
Virus en sistemas acuáticos
Métodos de recuperación
NO EXISTE!!!
• Adsorción-Elución
• Trampas
• Ultracentrifugación
• Otras técnicas
Virus en sistemas acuáticos
Concentración de partículas virales
Muestra con el virus es puesta en una MATRIZ
que lo absorve bajo condiciones específicas de
pH y fuerza iónica. El agua resultante es
desechada y las partículas virales eluidas de la
matriz en un volumen menor y concentradas en
el eluato por precipitación ácida y centrifugado.
(Katzenelson et al. 1976)
MATRIZ
Pads de Gasa
Membranas o Cartuchos
cargados: Electropositivos o
Electronegativos
Vidrio: Polvo o Lana
MATRIZMUESTRA DE
AGUA
Agua
resultante
Precipitación
ácida y
Centrifugación
Virus
concentrado
pH
Fuerza iónica
Los virus en la muestra son retenidos en un Filtro en virtud de su Masa
Molecular, independientemente de su carga eléctrica total.
Ultrafiltración. Presión/Flujo tangencial.
(Poynter et al. 1975; Katayama et al. 2002)
FILTROS y
MEMBRANAS
de diferente
Porosidad
MUESTRA DE
AGUA
Agua
resultante
Retención de
partículas
mayores
Virus
concentrado
Masa Molecular
Por PRESIÓN
Elución de la
membrana
7 um
0,45 um
Hidroextración. (Wellings et al. 1976)
MUESTRA DE
AGUA
Agua
resultante
Retención de
partículas virales
Virus
concentrado
Retención en Sólido
Higroscópico
Por DIÁLISIS
Elución de la
membrana
PEG 6000 o
Sacarosa
Bolsa de
membrana de
Diálisis
Varias Horas a 4ºC
• Ultracentrifugación
Virus en sistemas acuáticos
Concentración de partículas virales
Centrifugación, capaz de concentrar todos
los virus aplicando suficiente fuerza de
gravedad y tiempo.
MUESTRA DE
AGUA
CENTRIFUGACIÓNAgua
resultante
Pellet
Virus
concentrado
Resuspensión
FUERZA G
TIEMPO
• Otros métodos
Floculación. (Calgua et al. 2008)
MUESTRA DE
AGUA
LECHE
DESCREMADA
pH 3,5
HCl [1N]
pH 3,5
SALES MARINAS
Conductividad
>1,5 mS
Agitador Magnético
8-10 HORAS
Reposo
8-10 HORAS
Agua
resultante
Pellet
CENTRIFUGACIÓN
RESUSPENSIÓNVirus
concentrado
Virus en Sistemas Sólidos
Métodos de recuperación
Gránulo maduro – esférico – de lodo
activado formado por bacterias y
polímeros extracelulares. Colonizado
por ciliados (subclasse Peritrichia).
Image: SEM – scanning electron
microscopy.
Weber et al. (2007).
• En Lodos -> Biopelículas: Los gránulos consistentes en
bacterias, polímeros extracelulares, protozoarios y hongos
ALIMENTOS
BIVALVOS: ALIMENTACION POR FILTRACIÓN
SISTEMA DIGESTIVO
Victoria et al. 2004
• Purificación
• Concentración
• Detección
Virus en Sistemas Sólidos
Métodos de recuperación
Determinación del Volumen de muestra:
secado 50mL a 103ºC-105ºC
Homogenización
Agitación
magnéticaMaceración
(Stomacher)
Ultra-sonicación
Degradación / Elución de los virus de las
partículas sólidas
ELUYENTES
•Competenicia por el sitio activo. Ej: Caseína, Extracto de carne,
Aminoácidos (Lisina, Glisina, Ac. Aspártico)
•Disminución de interacción electroestática/hidrofóbica. Ej: Detergentes
(SDS, EDTA), agentes caotrópicos/anticaotrópicos.
• Extracción de ácidos nucléicos: Isotiocianato de
Guanidina y sílica (Boom et al. 2002) ó Kit de
extracción. Compuestos fenólicos (ej.Trizol)
• Técnicas de Biología Celular y Molecular:
- Cultivo Celular
- Electroforesis en gel de acrilamida (PAGE)
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Real time PCR (PCR cuantitativo)
Métodos de Detección
MUESTRA DE
AGUA
CONCENTRACIÓN Y
DETECCIÓN
CUANTIFICACIÓN
CARACTERIZACIÓN Y
TIPIFICACIÓN
En c/ 10 uL existen 4000 (4 x 103) copias
de genoma (partículas virales?)
En 1 Litro de muestra????
Cuántas copias de genoma (partículas virales)????
PARA LA INFECCIÓN….UNA SOLA PARTÍCULA VIRAL VIABLE BASTA!
Norovirus
Genogrupo GII
Genotipo GII.4
Importancia
• Brotes y Epidemias. Contención y paliación de
daños. Humanas, animales. Agroganadería.
• Manejo de sistemas hídricos. Plantas de
tratamientos afluentes y efluentes.
• Control de calidad de aguas de consumo,
alimentos y en la Industria.
• Zonas turísticas y recreacionales.
• Advertir a las autoridades nacionales e
internacionales. Legislación.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!!