Aislamiento y Purificación de Proteínas

CélulasTejidos

Lisis Sonicación, DetergentesCriofractura, Embolo-aspas

Protección de Proteínas

Aislamiento y Purificación de Proteínas

Homogenizado

Centrifugación

Diferencial

Gradientes

Centrifugación Diferencial

Centrifugación Diferencial

Centrifugación en Gradientes

Zonas de Velocidad

Centrifugación en Gradientes

Zonas de Velocidad

Centrifugación en Gradientes

TÉCNICAS PARA LASEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

CROMATOGRAFÍAS

COLUMNASCROMATOGRÁFICAS

Fase estacionariaMatriz

Fase móvilSolución

Cromatografía Filtración en gel(Exclusión por tamaño)

Cromatografía Intercambio Iónico

Cromatografía de Afinidad

TÉCNICAS PARA LASEPARACIÓN Y DETECCIÓN

DE PROTEÍNAS

INMUNOFLORESCENCIAELISA

ELECTROFORÉSIS

Biotina - Avidina

Biotina - Avidina

Biotina – Avidina - Enzima

Concepto Básico de Absorción y Emisión

Estructuras de Fluoroforos

Estructuras de Fluoroforos

Espectro de Excitación y Emisión

Molecular Fluorescent Probes

• Específicos (e.g. DAPI)

• Unión a proteínas

• Anticuerpos

• Expresión en células vivas u organismos

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia

There are Different Fluorescent Molecules for Different Jobs

See Molecular Probes Catalog; Sigma Catalog; CloneTech for GFP

Molecular probes

Detección con Ac - Conjugados

Detección con Ac - Conjugados

Detección con Ac - Conjugados

Detección con Ac - Conjugados

ENZIME – LINKED

IMMUNOABSORBANT ASSAYS

ELISA

ENZIME – LINKED

IMMUNOABSORBANT ASSAYS

ELISA

ENZIME – LINKED

IMMUNOABSORBANT ASSAYS

ELISA

Es una prueba rápida por la que un anticuerpoo antígeno se une a una enzima como mediopara detectar una relación entre el anticuerpoy el antígeno.

La reacción enzimática produce un cambio decolor relativo a la cantidad de proteínapresente.

ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

ELISA

ELISA

= Antígeno

Unión del Ag

Detección

ELISA SANDUCHE

Detección de Ag

Ag

Unión del Ac

Detección

= Antígeno

ELISA - Indirecto

Detección deAb / Ac

PAGE

WESTERN BLOT

Marcaje y purificación proteínas

Por Biotina - estreptavidina

Purificación Biotina - Avidina

Ethynyl

Azida

Ethynyl

Azida

labeling by azidohomoalanine (AHA)