By NA 1

Diagnosi Prenatale II

By NA 2

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

• Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche classiche la provenienza

• Frequenza alla nascita 0.14-0.72/1000• Difficile correlazione genotipo-fenotipo

in diagnosi prenatale• Importante il rilievo della

caratterizzazione molecolare

By NA 3

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

In più del 50% dei casi è oggi possibile fare previsioni fenotipiche corrette:

• Invdup15 (50% ESAC)

• Cromosomi sessuali

By NA 4

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

Amniocentesi paziente di 41 aa

Presenza di un ESAC in tutti i cloni

de novo piccole dimensioni

By NA 5

By NA 6

By NA 7

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

CBG positivo DA/DAPI positivoFISH centromero 15 positiva

Invdup(15)

Definizione del tipo

By NA 8

By NA 9

By NA 10

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

FISH sonde pericentromeriche(D15S11; GABR3) NEGATIVA

Invdup(15) tipo I

Assenza di anomalie del fenotipo

By NA 11

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

Rischio di Disomia Uniparentale 15q11-q13 da origine

postzigotica del marcatoreMaterna Paterna

s. Prader/Willi s. Angelman

By NA 12

By NA 13

By NA 14

D15S130 D15S165

P F M P F M

Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE

By NA 15

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE

CON MARCATORI POLIMORFICI DEL

CROMOSOMA 15

By NA 16

By NA 17

By NA 18

By NA 19

By NA 20

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

Amniocentesi paziente di 35 aa

Presenza di un ESAC

de novo piccole dimensioni

By NA 21

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

CBG positivo DA/DAPI negativoFISH 13,14,15,21,22,X,Y negativa

Rischio alterazioni fenotipiche 5%

Ecografia/Ecocardiografia

Riduzione rischio di 1/3

By NA 22

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

Paziente in gravidanza di 31 aa

Riscontro ecografico NT aumentata

By NA 23

Toshiba Instruments

By NA 24

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

NT aumentata

rischio aneuploidie

Prelievo villi coriali a 11 settimane

Presenza di ESAC de novo piccole dimensioni, bisatellitato

By NA 25

CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

FISH 13,14,15,21,22

Positiva per centromero 22

invdup(22)

Cat/Eye syndrome

By NA 26

Cat Eye syndrome

Malf. orecchio 86%Malf.anorettali 81%Malf. urogenitali 71%Coloboma occhio 61%

Altre Malformazioni

By NA 27

Cat Eye syndrome

Malformazioni cardiache62%

di cui 1/3 Anomalie del Ritorno Venoso Polmonare

By NA 28

Cat Eye syndrome

RITARDO MENTALE ??

Severo 7%Moderato/lieve 47%

By NA 29

Cat Eye syndrome

Assenza di correlazioni tra estensione/regioni geniche presenti nel cromosoma invdup(22) ed anomalie del fenotipo

By NA 30

Cat Eye syndrome

CES Tipo I vs CES Tipo II non ha utilità dal punto di vista clinico

By NA 31

By NA 32

By NA 33

By NA 34

By NA 35

By NA 36

By NA 37

Mosaicismo

• Amniocentesi cellule dall’epiblasto della massa cellulare interna.

• Villocentesi – Coltura a breve termine cellule del trofoblasto.

• Villocentesi – Coltura a lungo termine cellule dello stroma (mesoderma extraembrionario).

By NA 38

By NA 39

MOSAICISMO

• I Livello: singola cellula

• II Livello: due o più cellule in una flask con la stessa anomalia o singolo clone

• III Livello: due o più cellule in più flask con la stessa anomalia o almeno 2 cloni

By NA 40

Liquido Amniotico Mosaicismi

• Livello I 2.5-7 %

• Livello II 0.7-1.1 %

• Livello III < 0.2 %

By NA 41

MOSAICISMO

• PSEUDOMOSAICISMO

• MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion)

• MOSAICISMO VERO

La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali

By NA 42

Mosaicismo trisomia 11

Paziente di 29 anniIndicazione: familiarità s. Down

Cariotipo fetale

46,XX (10 cloni)/47,XX,+11 (1 clone)

Mosaicismo II livello

By NA 43

Linee Guida work-upModerato: altre 10 cellule dalla flask con anomalia oppure altri 12 cloni.

Flask

• Cr. Sessuale sovra-numerario (SC,MC)

• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SC, MC)

• 45,X - Monosomie (MC)

• Alt. bilanciate (MC)

• Marcatore (SC)

In situ

• Cr. Sessuale sovra-numerario (SCo,MCo)

• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SCo, MCo)

• 45,X - Monosomie (SCo, MCo)

• Alt. bilanciate (MCo)

• Marcatore (SCo)

By NA 44

Mosaicismo trisomia 11

Estensione analisi a 41 cloni

Cariotipo 46,XY (39 cloni)/47,XY,+11 (2 cloni)

Mosaicismo III livello

By NA 45

Liquido AmnioticoMosaicismi - Livello III

• Conferma sino al 40 % alla cordocentesi ed al 50%(autosomi), 80% (ESAC) e 90% (cr. sessuali) al follow-up

• Tipo di Cromosoma (es. ESAC)

• Utilizzo e limiti della Cordocentesi

By NA 46

Mosaicismo trisomia 11

• Solo 2 casi in letteratura, con bassa frequenza (2.7 e 5.5%), apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche

• Rischio s. Beckwith-Wiedemann da disomia uniparentale 11

By NA 47

Meccanismi UDP

• Complementazione gametica

• Recupero dello zigote trisomico

• Duplicazione mitotica

• Errore post-zigotico

By NA 48

By NA 49

DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11

Regione 11p15.5 eterodisomia paterna

Alterata espressione di geni da imprinting genomico

2 casi di s. Beckwith-Wiedemann

By NA 50

DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11

Polimorfismi Cromosoma 11 - Tecnica PAGE

P F M P F M P F M

By NA 51

Mosaicismo trisomia 11

• Esame citogenetico:Cariotipo 46,XY (150 metafasi)

Attesa Fenotipo nella norma(follow-up a 24 mesi)

• Screening molecolare con microsatelliti cromosoma 11:

Esclusione UDP

By NA 52

Mosaicismo trisomia 4

Paziente di 40 anniIndicazione: età

Cariotipo fetale

46,XX (31 cloni)/47,XX,+4 (9 cloni)

Mosaicismo III livello

By NA 53

Mosaicismo trisomia 4

Solo 3 casi in letteratura:- 2 con bassa frequenza ( 10%),

apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche

- 1 con an. faciali e malf. multiple: ad 1 anno buon follow-up

- Problema UPD

By NA 54

Mosaicismo trisomia 4Counselling

• Ecografia/Ecocardiografia fetale• Prelievo sangue funicolare per esame

cariotipo ed esclusione UPD

In caso di interruzione:Esame citogenetico su tessuti diversi

By NA 55

Mosaicismo trisomia 4

• Ipoplasia cerebellare

• Ventricolomegalia borderline

Fetal MRI

By NA 56

Mosaicismo trisomia 4

CAV completo

By NA 57

Mosaicismo trisomia 4

• Micrognazia• Ipotelorismo

• Deformità rachide (emivertebre)

• s. atresia esofagea

By NA 58

Mosaicismo trisomia 4 DISOMIA UNIPARENTALE

Polimorfismi Cromosoma 4 - Tecnica PAGE

D4S243 D4S175

P CF M P CF M

By NA 59

Diagnosi Malattie DNA

• Numero elevato malattie• Numero elevato di mutazioni (es.

Fibrosi cistica)• Coinvolgimento geni diversi (es. Retinite

pigmentosa)

By NA 60

Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti

Conoscenza gene/i

• Identificazione della specifica mutazione

By NA 61

Conoscenza geni

Mendeliane

• Talassemia• Fibrosi cistica• Chorea di Huntington• Distrofia di

Duchenne

Complesse(loci suscettibilità)

• ApoE Alzheimer• 19p13;Xq24 Cefalea• 12q;2q Diabete NID• 3q21 Psoriasi

By NA 62

Conoscenza geni

8000 malattie

geni noti 30%

(60-70% pazienti)

By NA 63

Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti

• Conoscenza gene/i implicati

Identificazione della specifica mutazione

By NA 64

Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)

•Una delle più comuni malattie genetiche dell’infanzia

•Ubiquitariamente diffusa nel mondo

•Colpiti pressochè esclusivamente maschi

•Ereditata come malattia recessiva X-linked

Si manifesta con debolezza muscolare progressiva. I muscoli mostrano una pseudo-ipertrofia, molto evidente nel polpacci: in realtà le fibre muscolari sono rimpiazzate da tessuto grasso/adiposo.

By NA 65

DIAGNOSI DMD

• Progressiva perdita muscolare e debolezza.

• Ridotta contrazione muscolare.

• Incurvamento della colonna vertebrale.

• Posizionamento doloroso delle articolazioni.

• Difficoltà nei movimenti quotidiani.

livelli CK

Biopsia muscolare

By NA 66

DIAGNOSI DMD • ANALISI DI DELEZIONE (60% circa dei casi):

– PCR multipla per 26 esoni dei 79 presenti nel gene.– Evidenziazione degli amplificati su gel-elettroforesi– Si diagnostica la delezione quando un prodotto di amplificazione è assente in due separate reazioni di amplificazione.

• ANALISI COMPLETA DEL GENE:– Se non è presente una delezione ampia, allora si ricorre ad uno studio dettagliato del gene mediante tecniche analitiche, sino al sequenziamento diretto.– Una volta trovata la mutazione nel probando, è possibile testare rapidamente qualsiasi soggetto della famiglia a rischio.

By NA 67

MULTIPLEX P.C.R.

By NA 68

DIAGNOSI DMD

Paziente di 27 anni in gravidanzacon fratello affetto da DMD

Analisi Fratello

Delezione degli esoni 45-52

Studio familiare di linkage

(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

Paziente Portatrice della Mutazione

By NA 69

DIAGNOSI DMD

Paziente 27 anni portatrice in gravidanza

Prelievo dei Villi coriali a 10 settimane

90% dei villi 10% dei villiESTRAZIONE DNA (se possibile)

Analisi molecolare Analisi cariotipocon PCR multipla

By NA 70

DIAGNOSI DMD

Paziente di 23 anni in gravidanza

con due nipoti deceduti per DMD

Studio familiare di linkage

(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

By NA 71

DIAGNOSI DMD

By NA 72

DIAGNOSI DMD

Paziente non Portatrice dell’Aplotipo associato alla DMD

DIAGNOSI PRENATALE

NON NECESSARIA !!!

By NA 73

DIAGNOSI DMD

Paziente di 26 anni in gravidanza (13 settimane)con due figli affetti da DMD

Analisi Figli

No Delezione degli esoni

Studio di linkage

By NA 74

DIAGNOSI DMD

Aplotipo fetale ricombinante

Rischio DMD

per il feto: 14%(62/79 esoni derivano

dal materno normale)

By NA 75

Fibrosi cistica

1000 variazioni di sequenza

- 83% (>800) mutazioni - 17% polimorfismi

Caucasici 70% F508

By NA 76

31 Mutazioni

più frequenti

D.R. = 80%

By NA 77

Caratterizzazione clinica complessa

Ragazza 17 anni

Alla età di 12 anni:

Iridi stellateRitardo mentale s. WilliamsPersonalità cocktail party

By NA 78

SINDROME DI WILLIAMS

• Dismorfismo faciale (“elfin facies”)

• Ritardo di crescita pre e postnatale

• Deficit cognitivi (alt. integrazione spazio-visiva); lieve RM

• Stenosi aortica sopravalvolare, s. polmonare, difetti di setto, prolasso mitrale

• Ipercalcemia infantile

DELEZIONE 7q11.23 gene ELN