Post on 30-Dec-2015
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タンパク質の結晶成長
- 実は結晶成長のモデル系? -
徳島大学工学部化学応用工学科鈴木良尚
1/39
目次
1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析
(面成長速度)4. 結晶化機構のミクロな解析
(ステップ前進速度と二次元核生成頻度)
5. まとめ
2/39
結晶成長とは?
Si wafer, d = 300 mm, (100) oriented
希望の品質・サイズの結晶を得るためにその結晶の成長機構を研究する学問
相転移の非平衡統計力学の一分野
3/39
結晶の生い立ち
…….
臨界核
核生成 成長
ANG
4/39
過飽和度
過飽和度大→成長速度大 同じ過飽和度でも成長速度変
化→速度論的要因
kTCC e /)/ln(
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結晶の育ち方
(a) 渦巻き成長
らせん転位
(b) 二次元核成長
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分子の結晶への取り込み過程
step
kink
w
s
h
Diffusion
Adsorption
Surface diffusion
Desorption
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目次
1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析
(面成長速度)4. 結晶化機構のミクロな解析
(ステップ前進速度と二次元核生成頻度)
5. まとめ
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モデルタンパク質
Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus)
asymmetric unit tetramer
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背景
Extraction
Purification
Structure Analysis
Bottle Neck!!!
Crystal Growth
*124
*89
*63
*19
*15*A summary of progress in the Human Proteome Structural Genomics PilotProject (http://proteome.bnl.gov/)
PDB holdings: 31306X-ray: 27188NMR: 4118(27-Sep-2005)
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モデルタンパク質
Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus)
asymmetric unit tetramer
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Visuri’s work50
300
0
t / min
Cry
stal
con
cen
trat
ion
/ g
l-1
200 MPa
150 MPa
100 MPa
0.1 MPa
K. Visuri et al.Bio/Technology8 (1990) 547.
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結晶の生い立ち
…….
臨界核
核生成 成長
ANG
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目次
1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析
(面成長速度)4. 結晶化機構のミクロな解析
(ステップ前進速度と二次元核生成頻度)
5. まとめ
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試料調製
Crystal Suspension
40℃ dissolution
0.45 mfiltration
StartingSolution
4 ℃ incubation
Seed crystals
Dilution
Solution forSolubilitymeasurements
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グルコースイソメラーゼ結晶
Space group: I222Unit cell*: a=9.388 nm, b=9.964 nm, c=10.290 nm (Z=2)
*Carrell, H. L.; Glusker, J. P.; Burger, V.; Manfre, F.; Tritsch, D.; Biellmann, J.-F. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 4440-4444.
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Morphology of the glucose isomerase crystal
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過飽和度
過飽和度大→成長速度大 同じ過飽和度でも成長速度変
化→速度論的要因
kTCC e /)/ln(
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{101} 面の成長速度過飽和度依存性
0
1
2
-2 0 2
R /
nm
s-1
100 MPa0.1 MPa
19/39
2
19
aKR s
)exp()1))(exp(3
2exp( 26/13/2
1 k
kR
渦巻き成長
二次元核成長(Birth & Spread model)
22
2
2 3
)101(
Tkk
20/39
0
1
2
-2 0 2
R /
nm
s-1
100 MPa0.1 MPa
渦巻き成長二次元核成長
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p / MPa (101) / kT
0.1
100 1.8 ± 0.3
4.1 ± 0.3
ステップレッジ表面エネルギーの
圧力変化
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目次
1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析
(面成長速度)4. 結晶化機構のミクロな解析
(ステップ前進速度と二次元核生成頻度)
5. まとめ
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結晶の面成長速度のみ→不確定要素あり
単位ステップの前進速度および二次元核生成頻度の測定が必要(しかも高圧力下!)
レーザー共焦点微分干渉顕微鏡 # で可能!#G. Sazaki, T. Matsui, K. Tsukamoto, et. al. J. Cryst. Growth 2004, 262, 536-542.
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目的
ステップ前進速度の圧力依存性 二次元核生成頻度の圧力依存性
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その場観察用高圧容器
Φ3 mm
45 ゜
50 mm
Φ30 mm
50 mm
18.3 mm
TERAMECS Co., Ltd. Max 100 MPa
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Sapphire window
Objective lens(Olympus, SLCPlanFl 40 X, WD = 7.6 mm, NA = 0.55 )
7.6 mm
Crystal
高圧容器内の結晶の配置と顕微鏡の位置関係
LCM – DIM(Olympus, FV300 + IX71 + U-DICTHC )
27/39
P = 0.1 MPa, 26.4 , 5.6 mgml℃ -128/39
P = 50 MPa, 26.4 , 5.6 mgml℃ -129/39
x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-100 -50 0 50 100
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150z-x
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
-50 0 50 100 150
6.935 nm
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h101 = 7.0 ± 0.7 nm
31/39
ステップ前進速度
))(exp(22esurf
kink CCkT
hwsv
step
kink kink
w
s
h
32/39
ステップ前進速度の濃度依存性
0
1
2
3
0 2 4
Va
ve /
nm
s-1
C-Ce / mgml
-1
50 MPa
25 MPa
0.1 MPa
33/39
)2sin
4exp()exp(
2sin2
)exp(
220
222202/1
Tk
fh
kTCwh
f
kT
GnZfJ
adsurf
sats
二次元核生成頻度34/39
二次元核生成頻度の圧力依存性
0.00E+00
1.00E+06
2.00E+06
3.00E+06
4.00E+06
5.00E+06
6.00E+06
0 20 40 60
p / MPa
Js /
m-2
s-2
35/39
二次元核生成頻度の過飽和度依存性
0
2 106
4 106
6 106
0 0.4 0.8 1.2 1.6
J s / m
-2s-2
/ -
50 MPa
25 MPa
0.1 MPa
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目次
1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析
(面成長速度)4. 結晶化機構のミクロな解析
(ステップ前進速度と二次元核生成頻度)
5. まとめ
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結論
Pressure V(101) Pressure Js(101) タンパク質結晶→ 結晶成長機構を探るモデル物質
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謝辞 本研究の一部は東北大学金属材料研究所研究部共同研究の
一環として行われました。改めて感謝申し上げます。
メンバー
佐崎 元 , 中嶋一雄 (東北大学金属材料研究所)
松本雅光 , 永澤眞(テラメックス株式会社)
田村勝弘(徳島大学工学部)
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x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-100 -50 0 50 100
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150z-x
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
-50 0 50 100 150
6.935 nm
h101 = 7.0 ± 0.7 nm
z-x
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
z-x
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
z-x
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
z-x
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
z-x
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
Morphology of the glucose isomerase crystal
Growth rate of {101} face
100 MPa0.1 MPa
0
1
2
0 20 40 60
R /
nm
s-1
C / mg ml -1
Ce(0.1 MPa)=2.6±0.5 mg ml-1
Ce(100 MPa)=3.1±0.9 mg ml-1
0
0.1
0 4 8
(a) 0.0 sec (b) 19.2 sec
(c) 38.5 sec (d) 57.6 sec
x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
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150
-50 0 50 100 150
x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
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130
150
-50 0 50 100 150
x-y
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
Dimer 形成3053.98 kJ/molTetramer 形成1200.42 kJ/molTetramer 形成972.80 kJ/molTetramer 間219.67 kJ/mol
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
y-z
-50
-30
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
-50 0 50 100 150
BackgroundUnfolding(denaturation)Activity
Pressure
Crystal
Molecule
Atmospheric pressure
Enzymaticactivity
背景背景 タンパク質は高圧力下で常圧下とは異なタンパク質は高圧力下で常圧下とは異な
る機能を発現(る機能を発現( αα キモトリプシン、タカキモトリプシン、タカアミラーゼアミラーゼ AA など)など)
→→高圧力下での分子立体構造の変化が原高圧力下での分子立体構造の変化が原因?因?
Native
Denatured
T
p
背景背景 深海微生物の増殖速深海微生物の増殖速
度などは高圧力下で度などは高圧力下で最も高い最も高い
→→高圧力下で最も高高圧力下で最も高い活性を持つタンパい活性を持つタンパク質が存在ク質が存在
絶対高圧性細菌の生育プロファイル(海洋科学センター Deepstar group )
以上の問題の解決のためには?以上の問題の解決のためには?
高圧力下でのタンパク質の分子構造の原高圧力下でのタンパク質の分子構造の原子レベルでの解明が必要子レベルでの解明が必要
NMRNMR (( Rafaee, et al. J. Mol. Biol. Rafaee, et al. J. Mol. Biol. 2003, 327, 857-8652003, 327, 857-865 ) )
XX 線結晶構造解析線結晶構造解析
モデルタンパク質モデルタンパク質 Glucose isomerase (from Glucose isomerase (from Streptomyces RubiginosusStreptomyces Rubiginosus, ,
I222, a=9.388 nm b=9.968 nm c=10.290 nm)I222, a=9.388 nm b=9.968 nm c=10.290 nm)
asymmetric unit tetramer
Future works
3D structure analysis of the crystal of pressurized protein (ex situ or in situ)
Effects of pressure on the Enzymatic activity
Concentration distribution
Growth24.7℃, 100 MPa
Dissolution44.1℃, 100 MPa
EquilibriumGrowth Dissolution
Bulk concentration → C Interference fringes
Crystals
Interference fringes
TG TDTe< <
Solubility curves
0
10
20
30
40
290 300 310
Ce /
mg
ml-1
T / K
0.1 MPa100 MPa
Table 1 List of the pressure effects on the solubility and the growth kinetics
Proteins Solubility Growth kinetics
Lysozyme (tetragonal form) Increase Inhibit
Lysozyme (orthorhombic form) Decrease Inhibit
Purafect subtilisin Increase Inhibit
Thaumatin* Decrease ?
Glucose isomerase Decrease (This work)
Table k1 and k2 for glucose isomerase and hen egg-white lysozyme crystals
Pressure / MPaProteins and Coefficients
0.1 50 100
Glucose isomerase
{101} faces
k1 / nm s-1 7 ± 6 0.16 ± 0.08k2 18 ± 2 3 ± 1
Hen egg-white lysozyme
Tetragonal form [12]
{110} faces
k1 / nm s-1 0.8 ± 0.6 3 ± 4 (7 ± 37)X106
k2 4 ± 2 9 ± 3 50 ± 10
k2 (k1 fixed)* 4 ± 2 5.4 ± 0.2 9.6 ± 0.6
{101} faces
k1 / nm s-1 0.1 ± 0.1 0.3 ± 0.5 0.9 ± 0.6
k2 1 ± 2 4 ± 3 6 ± 2
k2 (k1 fixed)* 1 ± 2 2.0 ± 0.3 2.59 ± 0.08
Orthorhombic form [21]{011} faces
k1 / nm s-1 5 ± 1 1.7 ± 0.6
k2 2.0 ± 0.4 1.5 ± 0.5
Table 3 List of the molecular surface energy of hen egg-white lysozyme and
glucose isomerase crystals.
Pressure / MPaProtein
0.1 50 100
Glucose isomerase
{101} / kT 4.1 ± 0.3 1.8 ± 0.3
{101} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 4.1 ± 0.3 3.52 ± 0.04
{101} / kT (k1(100 MPa) fixed) 2.68 ± 0.04 1.8 ± 0.3
Hen egg-white lysozyme
Tetragonal form
{110} / kT 1.9 ± 0.4 2.9 ± 0.5 6.6 ± 0.9
{110} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 1.9 ± 0.4 2.27 ± 0.04 3.02 ± 0.09
{101} / kT 1.0 ± 0.7 1.9 ± 0.8 2.5 ± 0.3
{101} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 1.0 ± 0.7 1.4 ± 0.1 1.58 ± 0.05
Orthorhombic form
{011} / kT 1.4 ± 0.1 1.2 ± 0.2
{011} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 1.4 ± 0.1 1.68 ± 0.02
k1 (3
)1/ 3a13/ 3h4 / 30 2 / 3Ce
4 / 3
exp( ad 2kink
3kT)
glass slides
silicone tubes
crystal
0.9 mm
2.0 mm
15 mm
spacer
silicone tubesspacer
Inner cell
Thermodynamic relations
H RlnCe
(1 /T )
S Rln Xe RT ln Ce
T
V RTlnCe
p
van’t Hoff plot
1
2
3
4
0.00315 0.00325 0.00335 0.00345
lnC
e
T-1 / K -1
0.1 MPa100 MPa
Protein (crystal form)
Pressure
0.1 MPa 50 MPa 100 MPa
Lysozyme(tetragonal)
Glucose isomerase
H / kJ mol-1:
S / J mol-1 K-1:
130±10 110±20 70±10
160±40 210±60
420±100 580±180
Lysozyme(orthorhombic)
460±40 400±60 280±40
35±3 35±5
140±10 140±20
V / cm3 mol-1:
H / kJ mol-1:
H / kJ mol-1:
S / J mol-1 K-1:
S / J mol-1 K-1:
-18±46
V / cm3 mol-1 :
V / cm3 mol-1 :
5±18
54±31
Thermodynamic functions
Growth rate of {101} face
0
0.4
0.8
0 2 4 6 8
R /
nm
s-1
100 MPa
0.1 MPa
Growth rate and Supersaturation
G
GG
G
Spiral Growth
Two dimensinal nucleation Growth
=/kT=ln(C/Ce)
: supersaturation Ce : equilibrium concentration
Adhesive Growth
W.D.=25.5 mm
Light source and camera
Objective lens (super long W.D.)
Beam splitter
Reference mirror
Adjustable (10 mm)
Sapphire window
Gold mirror
Seed crystal
Solution
Silicone tube
Quartz glass
Interference cell
Peltier element
Water jacket
(a)
(b) Volume of the cell: 36 µl
0.9 mm
Michelson interferometer
High-pressure vessel
Inner cell