Московская гимназия на Юго-Западе №1543Институт проблем передачи информации РАН

Изучение щелевых контактов методом гетерологической экспрессии в ооцитах

шпорцевой лягушки (Xenopus laevis)

Андреева А.Гладченко М.

Научные руководители:д.б.н. Панчин Ю. В.к.б.н. Попова Л. Б.

Москва, 2011 г.

Существуют различные способы межклеточных коммуникаций

Секреция сигнальных молекул в межклеточное пространство

Рис. 1. Выделение медиатора в межклеточное пространство для взаимодействия с соседней клеткой

http://virtual.yosemite.cc.ca.us/rdroual/Course%20Materials/Physiology%20101/Chapter%20Notes/Fall%202011/chapter_5%20Fall%202011.htm

Рис. 2. Обмен ионами и молекулами между клетками по щелевому контакту

http://virtual.yosemite.cc.ca.us/rdroual/Course%20Materials/Physiology%20101/Chapter%20Notes/Fall%202011/chapter_5%20Fall%202011.htm

Существуют различные способы межклеточных коммуникаций

Щелевые контакты, непосредственно соединяющие клетки

Строение щелевых контактов

Рис. 3. Схема строения белка коннексина, втроенного в клеточную мембрану.

Из шести субъединиц на мембране клетки образуетсягексамерный полуканал, который называется коннексон.

Рис. 4. Строение щелевого контакта.

Строение щелевых контактовИз двух полуканалов соседних клеток образуется единый щелевой контакт.

Мутации в генах щелевых контактов у

человека являются причиной так

называемой бессимптомной глухоты.

Заболевания, связанные с щелевыми контактами

Методика

1) Получение ооцитов

Рис. 6. Операция по извлечению ооцитов.

Рис. 5. Xenopus laevis, альбинос.

2) Снятие сосудистой оболочки

3) Снятие вителиновой оболочки

4) инъекция мРНК

Методика

механически ферментативный способ

В каждую из пар ооцитов вкалывали один из трех типов мРНК

Методика

Получение мРНК

Методика

Рис. 7, 8. Схема получения мРНК коннексина.

Методика

Рис. 9. Зеленое свечение ооцитов, инъецированных белками щелевых контактов, включающих последовательность GFP (или только GFP)и составленных парами, под люминисцентным микроскопом.

Электрофизиологический опыт

Методика

Рис. 10. Схематическое изображение двух клеток, с сопротивлениями R

2 и R

1 , соединенных межклеточным

контактом с напряжением r.

МетодикаЭлектрофизиологический опыт

Рис. 11. Схема электрофизиологического опыта.

МетодикаЭлектрофизиологический опыт

Рис. 12. Графики зависимости потенциала первой клетки (U1) и силы тока, требующейся для поддержания постоянного потенциала на второй клетке (I2) от времени.

Заключение

Мы освоили метод гетерологической экспрессии в полном объеме.

Также мы опробовали новый ферментативный способ очистки ооцитов от вителиновой оболочки с помощью субтилизина (протеазы 8). Этот способ оказался более удачным, чем существовавший ранее, что немного упростило довольно сложную методику изучения щелевых контактов.

Спасибо за внимание!

Список литературы: Yuri V. Panchin. Evolution of gap junction proteins – the pannexin alternative. The

Journal of Experimental Biology (2005), 1415-1419. Dwan A. Gerido, Adam M. DeRosa, Gabriele Richard, and Thomas W. White.

Aberrant hemichannel properties of Cx26 mutations causing skin disease and deafness. Am J Physiol Cell Physiol 293: C337–C345, 2007.

Shestopalov, V.I., Panchin Y. Cell Mol Life Sci, 65(3), 376 (2008). Gülistan Meşe, Eric Londin, Rickie Mui, Peter R. Brink, Thomas W. White. Altered

gating properties of functional Cx26 mutants associated with recessive non-syndromic hearing loss. Hum Genet (2004) 115: 191–199.

Martha Skerrett, Mary Merritt, Lan Zhou, Hui Zhu, FengLi Cao, Joseph F. Smith, and Bruce J. Nicholson. Applying the Xenopus Oocyte Expression System to the Analysis of Gap Junction Proteins. Methods in Molecular Biology, vol. 154: Connexin Methods and Protocols.

Jack R. Lee, Adam M. DeRosa and Thomas W. White. Connexin Mutations Causing Skin Disease and Deafness Increase Hemichannel Activity and Cell Death when Expressed in Xenopus Oocytes. Journal of Investigative Dermatology (2009), Volume 129.

Shoji Maeda, So Nakagawa, Michihiro Suga, Eiki Yamashita, Atsunori Oshima, Yoshinori Fujiyoshi & Tomitake Tsukihara. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5A°resolution. Nature, Vol 458, 2 April 2009.

Ю.В. Панчин (2009) Межклеточные каналы у животных.